Notch1對人臍帶間充質干細胞增殖、黏附及遷移影響的體外研究

王曉輝，羅 蕓，賈慶華，楊霄鵬，王 鯤，哈小琴

人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)是一種存在于人臍帶華通膠(Wharton＇s jelly，WJ)中的間充質干細胞，其發育來源于中胚層，形態和生物學特性與骨髓間充質干細胞相似，可以跨胚層誘導分化為骨、軟骨、骨骼肌、內皮細胞、心肌細胞及神經元等多種組織類型細胞，在組織再生和創傷修復等方面具有重要作用［1］，是臨床干細胞移植治療的理想種子細胞來源。目前已開展了hUCMSCs移植治療神經系統疾病、心血管系統疾病、糖尿病、肝臟疾病等多種類型疾病的臨床應用研究［2］。hUCMSCs可在多種細胞因子誘導下，向炎癥部位及缺血缺氧部位定向遷移，并且黏附、增殖，與其參與組織再生及損傷修復功能密切相關［3］。Notch信號通路是在上世紀初期由遺傳學家Mohr小組在果蠅體內發現。Notch信號通路存在于免疫系統、造血系統、神經系統、淋巴系統以及心血管系統等，參與了調控細胞分化、增殖、存活、遷移以及凋亡等生理及病理過程［4-5］。本研究中應用攜帶人Notch1受體胞內活性片段(Notch1 intracellular domain，NICD)基因的重組腺病毒轉染hUCMSCs，激活Notch信號通路，以期提高hUCMSCs的增殖、黏附及遷移能力，為hUCMSCs細胞聯合Notch1基因移植靶向修復受損組織提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 主要材料 本研究經蘭州軍區蘭州總醫院倫理學委員會批準，hUCMSCs細胞為實驗室前期研究中分離培養。腺病毒 Ad-GFP，滴度為 1．8×1010pfu/ml;Ad-GFP-NICD(Ad-NICD)，滴度為1．6 ×1010pfu/ml為實驗室前期制備、保存。α-MEM培養基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶等細胞培養試劑購自美國GIBCO公司，培養皿及培養板、Transwell小室購自美國Corning公司，甲基噻唑基四唑(MTT)購自美國Sigma公司，兔抗人β-Actin單克隆抗體、兔抗人Notch1單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，羊抗兔IgG-HRP購自北京中山金橋公司，ECL超敏化學發光液購自武漢博士德公司。

1.2 儀器設備 AC2-4S1型生物安全柜為新加坡ESCO公司產品，IX-71型活細胞成像工作站為日本Olympus公司產品，INC153型CO2培養箱為德國美墨爾科技公司產品，流式細胞儀為美國BD公司產品，ChemiDoc型化學發光成像系統為美國UVP公司產品，DG5033A自動酶標儀為南京華東電子集團公司產品，Mini-PROTEAN蛋白凝膠電泳系統為美國Bio-Rad公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 hUCMSCs的分離培養:原代hUCMSCs為實驗室前期工作中，經待產婦及其家屬知情同意后，采用組織貼壁培養法從健康新生兒臍帶中分離培養獲得，并且經流式細胞儀鑒定。hUCMSCs加入10 ml含有10%FBS的α-MEM完全培養基，接種于培養皿中，37℃、5%CO2培養箱中靜置培養。每3天進行細胞換液1次，當細胞融合至80%～90%時，PBS清洗2遍，消化回收細胞，按照1∶3的比例進行傳代。取第3～5代、對數生長期的hUCMSCs為實驗對象，根據不同腺病毒轉染分為實驗組(Ad-NICD組)、陰性對照組(Ad-GFP組)、空白對照組(未轉染腺病毒組)。

1.3.2 腺病毒轉染hUCMSCs:回收消化hUCMSCs，按照細胞密度5×105個/孔，接種到6孔培養板中，37℃、5%CO2培養箱中靜置培養24 h。更換為無血清的α-MEM培養基，按照MOI=50分別加入腺病毒Ad-NICD及Ad-GFP。培養4 h后，更換為含有10%FBS的 α-MEM 完全培養基，37℃、5%CO2繼續培養。鏡下觀察細胞形態和GFP蛋白表達情況。

1.3.3 MTT法檢測Notch1對hUCMSCs細胞增殖的影響:取對數生長期的hUCMSCs，細胞計數后稀釋細胞密度為5 ×104個/ml，按照100 μl/孔接種到96孔培養板中。細胞貼壁后按照實驗分組分別加入腺病毒Ad-NICD及Ad-GFP轉染。繼續培養，在24、48、72、96 h 時，更換無血清培養基 80 μl/孔，并加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl/孔，繼續培養4 h。棄上清，按照150 μl/孔加入DMSO溶液，微量振蕩器振蕩20 min，酶標儀檢測波長490 nm的吸光值，每個時間點設6個復孔。

1.3.4 流式細胞儀檢測Notch1對hUCMSCs細胞周期的影響:當hUCMSCs生長融合至80%時進行，消化回收細胞。消化回收細胞，離心管中加入1 ml－20℃預冷的70%乙醇，反復輕柔吹打細胞，形成單細胞懸液，4℃固定2 h。PBS洗滌2遍，加入2 ml PI綜合染液(0．005%PI、0．002%RNase A、0．1% 枸櫞酸鈉，w/v)，4℃避光孵育30 min。離心棄去PI染液，加入0．5 ml PBS重懸細胞，200目篩網過濾，流式細胞儀上機檢測。每組細胞重復檢測3次。

1.3.5 細胞貼壁實驗檢測Notch1對hUCMSCs黏附能力的影響:當hUCMSCs生長融合至80%時進行，消化回收細胞。消化回收細胞，細胞計數并將細胞稀釋為密度為1×105個/ml的細胞懸液，按照100 μl/孔接種到96孔培養板中。繼續培養24 h，期間每4小時回收細胞培養上清，流式細胞儀計數。按照公式細胞黏附率(%)=(1－上清細胞數/接種細胞數)×100%，計算細胞黏附率，每組細胞每個時間點設3組復孔。

1.3.6 Transwell小室觀察 Notch1對hUCMSCs遷移能力的影響:消化回收細胞，用無血清的α-MEM培養基將細胞稀釋成密度為5×105個/ml的細胞懸液。24孔培養板內，每孔加入600 μl的α-MEM完全培養基，放入Transwell小室，37℃孵育30 min。在Transwell小室中加入200 μl的細胞懸液，37℃、5%CO2培養箱中繼續培養24 h。取出Transwell小室置于4%多聚甲醛中，4℃固定30 min。用棉簽小心擦去上層未遷移細胞，Giemsa染色5 min，PBS中浸泡清洗除去多余染色液。將微孔膜小心裁切下來，下層膜朝上，滴加PBS封片，鏡下取5個視野(中央、12、3、6、9 點位置)計數，取平均值。

1.3.7 Western Blot檢測各組hUCMSCs中Notch1蛋白的表達:消化回收細胞，加入100 μl RIPA細胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 7．5;100 mmol/L NaCl;1 mmol/L EDTA;1%TritonX-100;0．1%SDS;0．5 mmol/L DTT;100 mg/L PMSF)，冰浴30 min。蛋白定量后，按照總蛋白 50 μg/孔，進行SDS-PAGE電泳，并將電泳產物轉移至NC膜。將NC膜置于5%的脫脂奶粉封閉1 h。加入1∶500稀釋的兔抗人β-Actin單克隆抗體和兔抗人Notch1單克隆抗體4℃孵育過夜。加入1∶1000稀釋的羊抗兔IgG-HRP抗體，37℃孵育2 h。ECL超敏化學發光液顯色，化學發光自動成像系統拍照。

1.4 統計學方法 應用SPSS 13．0軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，α=0．05為檢驗水準。

2 結果

2.1 hUCMSCs細胞形態學觀察及GFP蛋白表達情況 熒光下觀察:腺病毒成功感染細胞，實驗組和陰性對照組均出現了GFP蛋白的表達，并且隨著培養時間的延長其表達量增高;空白對照組未見GFP蛋白的表達。可見光下觀察:陰性對照組和空白對照組細胞體積變大，呈長梭形和多邊形，平鋪生長，當細胞鋪滿整個培養皿，呈漩渦狀，細胞數量豐富;實驗組細胞增殖速度明顯較快，細胞形成多個不完整的管腔樣結構，見圖1。

2.2 MTT法檢測Notch1對hUCMSCs細胞增殖的影響 利用MTT法測量hUCMSCs的OD 490 nm值。實驗組分別與空白對照組和陰性對照組比較，OD 490 nm值在培養24 h內差異無統計學意義(P＞0.05)，隨著培養時間的延長，實驗組 OD 490 nm值顯著高于空白對照組和陰性對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)，提示Notch1基因的表達能顯著促進hUCMSCs的增殖;陰性對照組與空白對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)，見表1。

2.3 流式細胞儀檢測hUCMSCs細胞周期 實驗組分別與空白對照組和陰性對照組相比較，hUCMSCs經腺病毒Ad-NICD轉染后，隨著Notch1信號通路的激活，其S期細胞比例顯著增高(P＜0.05)。說明在實驗組中更多細胞進入DNA合成期，細胞復制活躍，細胞增殖活性強。陰性對照組與空白對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)，見表2和圖2。

圖1 腺病毒轉染人臍帶間充質干細胞后熒光及可見光下細胞形態觀察(×40)

表1 3組人臍帶間充質干細胞OD 490 nm值(±s)

表1 3組人臍帶間充質干細胞OD 490 nm值(±s)

注:實驗組為Ad-NICD組，陰性對照組為Ad-GFP組，空白對照組為未轉染腺病毒組;與空白對照組比較，aP＜0.05;與陰性對照組比較，cP＜0.05

24 h 48 h 72 h 96 h實驗組 0．157±0．021 0．238±0．018ac0．429±0．031ac0．501±0．023組別ac 0．021陰性對照組 0．115±0．009 0．170±0．017 0．331±0．026 0．426±0．012空白對照組 0．132±0．017 0．177±0．011 0．317±0．007 0．380±

2.4 細胞貼壁實驗檢測Notch1對hUCMSCs黏附能力的影響 各組腺病毒感染hUCMSCs，通過流式細胞儀細胞計數，按照公式計算細胞黏附率。實驗組分別與空白對照組及陰性對照組相比較，在細胞培養4～8 h，3組細胞黏附率比較差異無統計學意義(P ＞0.05);繼續培養，在12、16、20 h 時實驗組細胞黏附率高于空白對照組與陰性對照組，差異有統計學意義(P＜0.05);當細胞培養＞24 h，3組hUCMSCs大部分細胞均已貼壁黏附，差異無統計學意義(P＞0.05)。陰性對照組與空白對照組細胞黏附率比較差異無統計學意義(P＞0.05)。說明Notch1基因的表達能顯著增強hUCMSCs的黏附貼壁能力，但當細胞培養時間大于24 h其促進作用不明顯，見表3。

2.5 Transwell小室觀察Notch1對hUCMSCs遷移能力的影響 利用Transwell小室，測定hUCMSCs的遷移能力，選取5個視野計數。遷移細胞數量實驗組為(69．00±6．73)個細胞，空白對照組為(18．00 ±3．38)個，陰性對照組為(17．00 ± 2．69)個，實驗組遷移細胞數量高于陰性對照組和空白對照組，差異有統計學意義(P＜0.05);陰性對照組和空白對照組遷移細胞數量比較差異無統計學意義(P＞0.05)。說明Notch1基因的表達能顯著增強hUCMSCs的細胞遷移能力，見圖3、4。

圖2 人臍帶間充質干細胞的細胞周期流式細胞儀檢測結果

表2 腺病毒感染后3組人臍帶間充質干細胞的細胞周期(±s)

表2 腺病毒感染后3組人臍帶間充質干細胞的細胞周期(±s)

注:實驗組為Ad-NICD組，陰性對照組為Ad-GFP組，空白對照組為未轉染腺病毒組;與空白對照組比較，aP＜0.05;與陰性對照組比較，cP＜0.05

組別 G0/G1期 S期 G2/M期實驗組 63．98 ±0．53 36．02 ±0．44ac 0．50 ±0．66陰性對照組 95．51 ±0．90 2．79 ±0．28 3．70 ±0．73空白對照組96．83 ±0．78 2．62 ±0．11 2．03 ±0．59

2.6 Western Blot檢測hUCMSCs中Notch1蛋白的表達 提取各組培養3 d的hUCMSCs的總蛋白，Western Blot檢測Notch1蛋白的表達，圖形軟件分析條帶灰度值，按照公式(Notch1灰度值/Actin灰度值)計算Notch1蛋白相對表達量。Notch1蛋白相對表達量實驗組為(1．385±0．156)倍，空白對照組為(0．361±0．075)倍，陰性對照組為(0．423±0．054)倍，實驗組高于空白對照組和陰性對照組，差異有統計學意義(P＜0.05);陰性對照組與空白對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。證實腺病毒Ad-NICD轉染hUCMSCs后，可顯著促進細胞Notch1蛋白的表達，見圖5、6。

表3 不同時點3組人臍帶間充質干細胞的細胞黏附率(± s，%)

表3 不同時點3組人臍帶間充質干細胞的細胞黏附率(± s，%)

注:實驗組為Ad-NICD組，陰性對照組為Ad-GFP組，空白對照組為未轉染腺病毒組;與空白對照組比較，aP＜0.05;與陰性對照組比較，cP＜0.05

時間(h)實驗組 陰性對照組 空白對照組4 16．18 ±3．08 13．60 ±3．44 15．33 ±4．31 8 28．89 ±2．75 24．43 ±4．31 24．58 ±3．20 12 76．79 ±3．64ac 52．08 ±4．58 51．81 ±4．08 16 88．78 ±5．43ac 70．55 ±3．57 63．31 ±6．84 20 103．48 ±4．29ac 88．01 ±5．06 87．31 ±6．84 24 102．20 ±4．33 94．86 ±4．65 95．52 ±1．90

圖3 人臍帶間充質干細胞的遷移能力觀察(Giemsa×40)

3 討論

干細胞的定向遷移、局部黏附并增殖稱為干細胞的歸巢作用。當組織損傷發生后，骨髓會迅速動員多種干細胞遷移至病變部位，產生自然的代償性修復作用，而通過各種途徑移植的外源性干細胞，也會定向歸巢至損傷部位，發揮治療作用。干細胞歸巢效率是干細胞移植治療心肌梗死、脊髓損傷、帕金森病、老年癡呆等疾病的關鍵因素，但其機制尚未完全清楚。目前關于干細胞遷移研究較多的是基質細胞衍生因子(stromal cell-derived factor，SDF-1)及其受體CXCR4。體內研究表明，hUCMSCs受到了腫瘤細胞分泌SDF-1和血管內皮生長因子(vascular endothelil growth factor，VEGF)等趨化因子的誘導而向腫瘤組織遷移，可作為穩定、有效的藥物載體及基因治療載體，介導轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)或抗腫瘤藥物等作靶向治療，能有效縮小實體腫瘤體積［6-7］。

圖4 Transwell小室測定3組人臍帶間充質干細胞細胞遷移能力

圖5 人臍帶間充質干細胞中Notch1蛋白的表達情況

圖6 人臍帶間充質干細胞中Notch1蛋白的相對表達量半定量分析

在組織損傷修復中，損傷部位血供的恢復及改善是決定修復作用的關鍵因素，僅僅單純應用細胞因子促進修復不足以達到復雜的創傷愈合或局部血管再生的目的，而干細胞聯合基因導入治療的應用可以通過誘導細胞定向分化、細胞因子及生長因子的旁分泌、促血管新生等聯合作用機制來影響局部微環境，從而有效地促進傷口愈合，縮短治療時間［8-9］。

1993年由Hockel等最早提出的應用治療性血管新生療法，是指通過血管新生因子的作用，刺激局部血管的再生而形成新的毛細血管網，使其與局部細胞、組織的生理需求相適應，達到保護損傷組織及修復再建的治療目的，是目前缺血性疾病治療、創傷修復、組織再生等領域備受矚目的研究重點［10］。血管新生是指干細胞通過誘導、分化而形成內皮祖細胞(EPC)，EPC對缺血缺氧及損傷炎癥部位具有趨化歸巢作用，定位遷移、黏附后增殖分化為內皮細胞，最終分化成熟并與原有血管相連接，形成新的毛細血管網絡［11］。血管新生是一個極其復雜的過程，多種生長因子、細胞因子及多種細胞參與其中，受到復雜的信號通路的調控。

Notch信號通路由Notch受體、Notch配體(DSL蛋白)、轉錄因子CSL(一類DNA結合蛋白)和下游效應物組成。現有研究表明，Notch信號通路在促進EPC增殖、分化及動靜脈轉化并維持干細胞的未分化狀態、血管生成中有重要的調控作用［12］。Notch信號通路通過靶細胞直接接受相鄰細胞刺激的側向激活效應，可將信號直接傳遞到細胞核，然后進一步激活下游靶基因轉錄調控，避免其他信號的干擾，特異性強，利于細胞分化起始過程的精確調控［4］。Notch1在乳腺癌組織中表達高于周圍正常組織，和雌激素受體(ER)、HER-2等分子分型的表達關系密切，是乳腺癌發生、發展的重要因素［13-14］，同時Notch1的表達水平與乳腺癌細胞的侵襲、遷移能力呈高度正相關，阻斷該通路可抑制乳腺癌細胞的侵襲、遷移［15］。金屬蛋白酶(MMPs)是一組非溶酶體酶的蛋白水解酶，是使胞外基質降解的主要酶。在對培養15～18代的骨髓間充質干細胞研究時發現，骨髓間充質干細胞不僅表達SDF-1/CXCR4，同時表達間充質MMPs，能降解細胞外基質，有助于干細胞的動員和遷移歸巢［16-17］，而缺氧微環境與MMPs的分泌表達密切相關［18］。在胰腺癌細胞研究中發現，缺氧環境可激活Notch1信號途徑，誘導MMP-2及MMP-9表達，與基底膜表面受體如纖維連接蛋白和層黏蛋白結合，進而降解基底膜和基質，最后使腫瘤細胞能夠向周圍組織浸潤［19］。

本研究中，我們以hUCMSCs為研究對象，通過前期制備的人Notch1受體胞內活性片段NICD重組腺病毒Ad-NICD轉染，觀察Notch1基因對hUCMSCs細胞增殖、黏附及遷移能力的影響。Ad-NICD和Ad-GFP轉染后的hUCMSCs可表達GFP蛋白，證實了腺病毒成功轉染入了hUCMSCs。通過MTT檢測，Ad-NICD具有促進hUCMSCs增殖的作用，進一步檢測細胞周期，發現S期細胞比例顯著增高，說明細胞DNA復制活躍，細胞增殖活性強。細胞貼壁實驗證實，在hUCMSCs消化培養早期，Ad-NICD能促進細胞黏附，而隨著培養時間延長，其促進作用不明顯。Transwell小室觀察細胞遷移，實驗組遷移細胞數量顯著大于空白對照組，提示Notch1信號通路激活能提高細胞遷移能力。同時Western Blot實驗檢測進一步發現，實驗組細胞高表達Notch1蛋白，進而證實了Notch1具有促進hUCMSCs細胞增殖、黏附及遷移的作用。

本研究結果表明，Notch1具有促進hUCMSCs細胞增殖、黏附及遷移的作用。我們可以通過將外源Notch1基因導入hUCMSCs，提高干細胞的歸巢效率，增強其組織損傷修復及血管新生的能力。本研究僅僅開展了關于Notch1基因導入hUCMSCs后，細胞生物學特征改變的研究，其具體作用機制及SDF-1/CXCR4、MMPs等與細胞歸巢密切相關分子的表達，將是下一步的重點研究內容。

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