NLRC3真核表達載體的構建及轉染

宛 瑩，張世冬，梁 爽，聶德志＊

（1.四平中心人民醫院中心實驗室，吉林 四平136000；2.吉林省拓華生物科技有限公司，吉林 四平136000）

炎癥在大部分腫瘤疾病中是一種普遍存在的臨床癥狀。NLR蛋白家族中的大部分成員是細胞內先天免疫系統的重要傳導因子，對炎癥起到促進作用，但是最近研究表明，該家族中的NLRC3蛋白可以通過作用于轉錄因子NF－k B進而抑制Toll樣受體，NLRC3直接與NF－k B的一個關鍵性的調節物TRAF6分子相互作用，形成 “蛋白TRAF復合體（TRAFasome）”，最終可達到對炎癥的抑制作用［1］。本試驗選擇質粒pcDNA3.1/myc－hisA 作為載體，將NLRC3基因與其進行重組，為篩選獲得穩定表達NLRC3的CHO細胞及NLRC3單克隆抗體的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸埃希菌 DH5α，質粒pcDNA3.1/myc－hisA均由本實驗室保存。Primer STAR HS DNA polymerase、T4DNA連接酶、Xba I、HindIII購自大連寶生物公司。

1.2 方法

1.2.1 合成序列

在GeneBank上查找NLRC3序列（mRNA ID：NM＿178844），選取序列中的編碼基因部分進行引物設計并送南京金斯瑞生物公司合成，根據引物合成參數進行分段PCR。OverlapPCR前期PCR循環條件如下：95℃5min；95℃30s，62℃30s，72℃30 s，3個循環；95℃30s，67℃30s，72℃30s，30個循環；72℃6min。根據引物合成NL1－NL6。

合成NLRC3序列全長。PCR循環條件如下：95℃5min；95℃30s，62℃30s，72℃30s，3個循環；95℃30s，67℃30s，72℃30s，30個循環；72℃6 min。

使用上海TIANgel Midi Purification Kit純化PCR產物。瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 克隆 NLRC3

1.2.2.1 連接 NLRC3與載體pcDNA3.1mychis

通過Xba I和HindIII雙酶切將目的基因NLRC3連接到pcDNA3.1mychis并轉化到DH5α大腸埃希菌制備感受態細胞中

1.2.2.2 鑒定陽性克隆 ①提取質粒：選用TIANprepare Mini Plasmid Kit提取質粒。回收的質粒溶液保存到－20℃。②酶切鑒定陽性克隆：將①得到的質粒溶液進行酶切，將酶切產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。③PCR鑒定陽性克隆：將①得到的質粒溶液進行PCR鑒定，取PCR產物瓊脂糖凝膠電泳檢測。④測序鑒定：將①得到的質粒送南京金斯瑞生物公司測序，將測序結果在Gen－Bank中進行BLAST比對，挑取比對結果一致度100%的陽性克隆進行大量擴增，并采用HighPrue Plasmid Kit進行質粒大提，提取產物－20℃保存備用。

1.2.3 擴增培養NLRC3陽性克隆

將比對結果一致度100%的陽性克隆進行大量擴增，并采用HighPrue Plasmid Kit進行質粒大提，提取產物－20℃保存備用。

1.2.4 細胞與重組體轉染

按Lipofectamine 2000說明書將重組體pcDNA3.1/myc－hisA－NLRC3 轉染到 MSC 細胞中并培養。

1.2.5 細胞篩選

通過 G418篩選培養基（500μg/ml）10%FBS α－MEM培養基，進行亞克隆篩選并或凍存。

1.2.6 蛋白印跡法鑒定轉染NLRC3的MSC細胞

收集的細胞和上清液抽提細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。SDS－PAGE凝膠電泳后轉印到PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉后加入抗NLRC3（1∶100稀釋）4℃孵育過夜，與辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶2 000稀釋）室溫孵育1h，ECL處理后X光膠片上曝光。結果以目的蛋白條帶與內參蛋白條帶光密度的比值表示。

2 結果

2.1 NLRC3質粒酶切鑒定結果及質粒PCR鑒定結果

酶切鑒定結果，通過電泳圖顯示表明目的基因成功插入到載體中（圖3），PCR結果通過電泳圖譜表明，經特異性引物擴增，可成功獲得目的基因（圖4）。

圖2 NLRC3重組體質粒酶切鑒定

圖3 NLRC3重組體質粒PCR鑒定

2.2 測序鑒定結果

如測序峰圖所示，測序信號特異性較強（圖4）。

圖4 NLRC3重組體質粒部分測序峰圖

經NCBI中BLAST比對，序列與目標序列100%一致。

2.3 Western blotting鑒定NLRC3的表達

Western blotting結果表明，在NLRC3轉染的MSC中有大量NLRC3表達，而在未轉染的MSC中NLRC3的表達較少，幾乎沒有（圖7）。

圖5 Western blotting NLRC3表達結果

3 討論

2012年8月研究者們首次發現NLRC3蛋白的特殊抗炎癥作用。NLR蛋白家族中的大多數成員起著炎癥促進物的作用。其中，一種新鑒定出的NLRC3蛋白，能夠抑制由NF－κB控制的主要炎性通路。NF－κB激活長期以來就與炎癥和促進癌癥產生相關聯［2］。NF－κB是一種重要的轉錄因子復合物，通過激活細胞因子級聯反應，抑制炎性細胞凋亡從而加劇疾病的發生。NLRC3通過一種完全不同的機制來抑制這個主要的炎性通路。通過直接與分子TRAF6相互作用并形成一種新的 “蛋白TRAF復合體（TRAFasome）”的蛋白復合物，抑制NF－κB與TRAF6的結合，影響TRAF6的降解和泛素化，從 而 抑 制 促 炎 癥 信 號 的 傳 遞［3－5］。雖 然NOD1和NOD2是激活NF－κB炎癥通路的重要成分，而NLR蛋白對這一通路的負面影響及其炎癥應答還沒有被廣泛的認可。但是有研究證據表明在很多情況下，NLRC3可以在巨噬細胞內作為一個抑制炎癥因子產生的調控物質，它可以削弱由于炎癥因子的產生而造成的機體的內毒素休克模型。在沒有NLRC3存在的情況下，炎癥反應速度加快。

本研究使用目前應用最為廣泛的真核表達載體pcDNA3.1/myc－hisA 成功構建含有 NLRC3 基因的重組真核載體 pcDNA3.1/myc－hisA－NLRC3，并成功轉染到人間充質干細胞中，為NLRC3干細胞轉染提供了新的理論基礎，從而更好服務于NLRC3對抗炎癥的作用研究。

［1］Monika S，Albert G Z.The innate immune sensor NLRC3attenuates Toll－like receptor signaling via modification of the signaling adaptor TRAF6and transcription factor NF－kB［J］.Nat immunol，2012，9（13）：823.

［2］Skaug B，Jiang X，Chen ZJ.The role of ubiquitin in NF－κB regulatory pathways［J］.Annu Rev Biochem，2009，78：769.

［3］Marinis JM，Homer CR，McDonald C，et al.A novel motif in the Crohn’s disease susceptibility protein，NOD2，allows TRAF4to down－regulate innate immune responses［J］.J BiolChem，2010，286（3）：1938.

［4］Heyninck K.The cytokine－inducible zinc finger protein A20inhibits IL－1－induced NF－κB activation at the level of TRAF6［J］.FEBS Lett，1999，442（2－3）：147.

［5］Deng L，Wang C，Spencer E，et al.Activation of the IκB kinase complex by TRAF6requires a dimeric ubiquitin－conjugating enzyme complex and a unique polyubiquitin chain［J］.Cell，2000，103（2）：351.