甘藍型油菜pol-CMS雜交種純度SSR鑒定與田間鑒定單株吻合率研究

王同華，陳衛江，王建喜

（湖南省作物研究所，湖南 長沙410125）

利用雜種優勢是提高油菜產量的重要途徑。目前，我國的油菜雜種優勢利用主要有細胞質雄性不育（CMS）、細胞核雄性不育（GMS）、自交不親和（SI）和化學殺雄等途徑[1]。其中，在我國目前生產應用中以波里馬細胞質雄性不育（pol-CMS）雜種為主導類型。但該類型雜交種母本不育系育性存在溫度敏感的特性[1-2]，即低溫條件下易出現育性恢復現象，并以自交方式產生母本假雜種，嚴重影響雜交種的純度。因此，對雜交種進行快速、準確的純度鑒定，是確保油菜安全生產的重要保證。

目前，我國油菜種子純度鑒定仍以傳統的田間種植鑒定為主，該方法雖簡單直觀，但需要耗時近一個生長季節，不適合當前“北制南用”的雜交種生產需求。因此，快速、準確的種子純度檢測方法顯得十分重要。隨著分子生物學技術的發展，分子標記技術在研究中的應用越來越廣。其中，SSR標記具有數量豐富、共顯遺傳、穩定性好[3-5]，且已經具備簡單快速的分析方法[6-7]，在油菜種子純度鑒定中已作為的首選標記得到廣泛應用。但與其他作物一樣，油菜SSR標記鑒定結果也存在與田間鑒定結果不吻合的現象[7-9]，而以往的報道多側重樣品結果的群體間對應研究，大多采用回歸方程對結果進行校正，而對該兩種鑒定方法間單株吻合率的研究報道甚少。研究以長江中游區推廣面積較大的3個甘藍型油菜pol-CMS雜交品種為對象，通過分析雜交制種樣品SSR鑒定和田間鑒定的單株一一對應分析，更有效地探討SSR標記技術在油菜雜交種純度鑒定應用中的準確性，旨在為我國油菜雜交種的生產與銷售提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為灃油737、豐油701、灃油520三個甘藍型油菜pol-CMS雜交品種及其親本相關信息見下表1，其中每品種取4份雜交制種樣品，每份樣品隨即取400粒種子播種于湖南省作物研究所試驗場。每份待測樣品鑒定小區8行，行長2.0m，行距0.5m，均勻播種，全生育期不間苗。

表1 供試雜交油菜品種的父母本及審定情況

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品DNA提取 在供試材料生長至9～11葉期時，從每個鑒定小區一端順序數192個單株進行吊牌編號，并取中間幼嫩葉片2 cm2左右于2.0 mL離心管中，－20℃保存用于SSR標記檢測。DNA提取參照王同華等[7]報道的簡便方法進行。

1.2.2 SSR分析 試驗所用112對SSR引物序列來源于http://uksrop.net，并由上海博尚生物技術有限公司合成。SSR-PCR反應體系參照陸光遠等[6]報道的方法進行，PCR產物經3%的瓊脂糖凝膠電泳分離，并用紫外成像系統進行觀察讀帶。SSR純度（%）=（檢測株數－母本帶型數－父本帶型數）×100/檢測株數。

1.2.3 田間鑒定 在供試材料發育至盛花期時，將上述192個吊牌編號的單株，根據育性表現進行調查，田間鑒定純度（%）=（檢測株數－不育株數－異型株數）×100/檢測株數。

2 結果與分析

2.1 SSR引物篩選

研究利用112對SSR引物對供試3個雜交品種的父母本間進行PCR擴增，篩選到可將灃油737、豐油701、灃油520雜交種與母本區分開的引物分別為3、7、3個。根據帶型清晰度、主帶差異大小和穩定性，最終確定以SSR引物CB10373、Na10-D09、CN48分別作為灃油737、豐油701、灃油520的雜交種純度鑒定引物（見圖1）。其中引物CB10373在灃油737母本擴增出200 bp的片段，而在父本擴增出200 bp與220 bp的2個片段；引物Na10-D09在豐油701母、父本間分別擴增出250 bp、170 bp的片段；引物CN48在灃油520母、父本間分別擴增出170 bp、2 100 bp的片段。因此，該3個SSR引物可以用于3個供試雜交品種的純度鑒定。

圖1 三對SSR引物對供試品種父母本DNA的PCR擴增

2.2 SSR鑒定結果與田間鑒定結果的群體對比

利用篩選得到的SSR引物對供試材料進行PCR擴增，擴增產物經瓊脂糖凝膠檢測均得到清晰、穩定的條帶（部分擴增結果見圖2），可以確保SSR標記鑒定過程無讀帶偏差出現。從表2中可以看出，SSR標記鑒定和田間種植鑒定的結果高度一致，12個供試樣品中有8個結果完全相同，其他4個樣品的鑒定結果差異在2%以內，兩種鑒定方法的平均偏差僅為0.35%，表明SSR標記鑒定結果與大田種植鑒定的結果是一致的。此外，對12個樣品的鑒定數據進行分析，可以看出存在差異的4個樣品的鑒定純度均較差，在田間種植鑒定中主要表現為異型株，而在SSR標記鑒定中可能表現為父本或母本帶型。

圖2 引物CB10373對供試樣品Y2的SSR-PCR擴增

2.3 SSR鑒定單株與田間鑒定單株結果吻合率分析

從田間種植鑒定和SSR標記鑒定結果對比分析結果（表2）中可以看出，12份供試樣品的單株吻合率均在97%以上，其中有6個樣品的吻合率為100%。其中，不吻合情況主要有可育株數檢成母本帶型、不育株檢成雜交種帶型、異型株數檢成雜交種帶型3種情況。對不吻合單株的表現進行分析，發現上述3種情況的出現呈隨機狀態，沒有明顯的規律性。造成兩種鑒定結果不吻合的原因可能與農藝性狀與分子標記間不關聯、雜種親本的純合程度、制種田塊自生苗類型以及制種環境的影響等因素有關，其確切原因需要進一步研究。

3 討論

利用SSR標記鑒定甘藍型油菜雜交種具有簡便、快速、不受環境因素影響、鑒定結果穩定性好等優點，目前在油菜雜交種純度鑒定中已廣泛應用[5，10]。以往關于SSR標記在作物種子純度鑒定的準確性研究主要集中在與田間種植鑒定純度結果的群體間對應上，研究者通常利用SSR標記和田間種植鑒定結果對比，建立回歸方程以校正兩種方法的鑒定誤差。筆者認為這種做法存在著一定的局限性：首先，種植鑒定受土壤、肥力和氣候等條件影響，弱苗和不能成苗的種子得不到準確觀測值，而室內SSR標記鑒定可對這部分種子作出準確判斷，得到樣品的原始純度；其次，種植鑒定與室內SSR標記鑒定是對同一樣品的不同次抽樣鑒定，抽樣誤差也可導致鑒定結果出現偏差。另外，種植鑒定主要根據品種形態特征和生物學性狀進行判定，受檢測人員經驗水平和樣品親本的遺傳差異度影響較大，也是造成結果差異的重要原因。鑒于此，研究以甘藍型油菜雜交種樣品同一抽樣樣品田間單株為研究對象，通過SSR標記和田間種植鑒定的一一對比分析，結果表明該兩種方法鑒定結果具有高度的一致性，證明利用SSR標記鑒定甘藍型油菜雜交種的純度是準確可靠的。

表2 田間種植鑒定和SSR標記鑒定的純度結果

表3 供試樣品的田間種植鑒定和SSR標記鑒定單株吻合率結果

對于研究中出現的極少數不吻合單株，筆者認為主要有3個方面的原因：一方面為制種田或鑒定田自生苗的干擾，表現為SSR母本帶型單株育性表現卻正常；另一方面，制種環境隔離不當導致無恢復基因外源花粉漂入，可能造成SSR雜種帶型單株卻表現為不育；此外，來自收獲、晾曬、運輸和包裝過程的機械混雜，在SSR鑒定中可能表現為父母本或雜交種帶型，也是造成鑒定結果不吻合的因素。因此，在實際生產應用中要綜合考慮制種環境、管理措施的影響，根據需要對兩種鑒定方法綜合應用，以確保鑒定結果的準確性。

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