藏靈菇源酵母菌和乳酸菌降膽固醇蛋乳發酵飲料的研制

張 晶，張紅星，謝遠紅，劉 慧*

（1.北京農學院 食品科學與工程學院，北京 102206；2.農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室，北京 102206）

隨著生活水平的不斷提高，人們對飲料產品的功效要求越來越高。國內外已有蛋乳發酵飲料研制成功的報道，但大多利用普通酸奶菌種研制而成，并沒有降低膽固醇的功效。藏靈菇中含有60%～70%的乳酸菌，其他為酵母菌、醋酸菌等[1]。人們直接將藏靈菇添加到經加熱滅菌，冷卻后的牛乳中，使之發酵而生成具有酸味和起泡性的酒精性保健飲料[2]，長期飲用該種飲料可以調節血清膽固醇水平，改善動脈硬化，預防心臟病等病癥。劉慧等[2-6]研究表明，藏靈菇源馬克斯克魯維酵母菌M3、干酪乳桿菌KL1、嗜熱鏈球菌Tx、乳酸乳球菌乳酸亞種KS4菌株在體內、體外具有較強的降膽固醇功效。有關利用藏靈菇源乳酸菌和酵母菌制備降膽固醇蛋乳飲料尚未見國內外文獻報道。降膽固醇蛋乳飲料是以雞蛋和牛奶為原料，采用藏靈菇源乳酸菌和酵母菌進行二次混合發酵研制而成的，亞健康人群通過飲用該種飲料可達到預防高膽固醇血癥的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：馬克斯克魯維酵母菌（Kluyveromycesmarxianus）M3、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、Tx干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）KL1、乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactissubsp.lactis）KS4，均從吉林藏靈菇中篩選得到，并鑒定為產生膽鹽水解酶[7-9]，具有降低膽固醇功能的菌株。

材料：新鮮雞蛋、蒙牛純牛奶、綿白糖（市售）。

試劑：鄰苯二甲醛、無水乙醇、冰醋酸、濃硫酸、甲醇、氯仿、膽固醇、氫氧化鈉（分析純）。

1.2 儀器與設備

BCD-301型冰箱：青島海爾；LS-B5OL型立式壓力蒸汽滅菌器：江陰濱江醫療設備廠；GHP-9160型隔水式恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；SW-LJ-IFD型潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；BS224S型分析天平：賽多利斯科學儀器有限公司；HZS-HA型水浴振蕩器：哈爾濱市東明醫療儀器廠；DT-10d型高精度循環恒溫水浴槽：北京德天佑科技發展有限公司；22PC型可見分光光度計：上海棱光技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵液的制備

（1）乳酸菌發酵液的制備

將活化好的KL1、Tx、KS4三株菌按2%的接種量分別移入滅菌牛奶三角瓶中，37℃培養12h。一次發酵接種前將3株菌按1∶1∶1的比例混合使用。

（2）酵母菌發酵液的制備

將活化好的M3菌種按1%～2%的接種量移入滅菌牛奶三角瓶中，28℃培養20h～24h備用。

1.3.2 飲料的工藝流程

1.3.3 降膽固醇蛋乳發酵飲料二次發酵條件確定

（1）發酵溫度的選擇：一次發酵（乳酸菌發酵）條件：3%總接種量，接種比例KL1∶KS4∶TX=1∶1∶1，43℃發酵8h。二次發酵（酵母菌發酵）M3菌株接種量為2%，發酵時間為24h，發酵溫度分別為26℃、28℃、30℃、32℃、34℃，每組3個重復。將產品4℃后熟24h，以感官評分為試驗指標確定發酵溫度。

（2）發酵時間的選擇：在上述試驗結果基礎上，M3菌株接種量為2%，發酵時間分別為20h、24h、28h、32h、36h，每組3個重復。將產品4℃后熟24h，以感官評分為試驗指標確定發酵時間。

（3）接種量的選擇：在上述試驗結果基礎上，M3菌株接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%，每組3個重復。將產品4℃后熟24h，以感官評分為試驗指標確定接種量。

1.3.4 正交試驗優化二次發酵條件

選擇發酵溫度、發酵時間、接種量為試驗因素，采用3因素3水平正交試驗優化二次發酵條件，以后熟前后感官評分為試驗指標確定降膽固醇蛋乳發酵飲料最佳發酵條件。

表1 蛋乳發酵飲料發酵條件優化正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of egg and milk beverage

1.3.5 試驗指標測定方法

（1）酸度的測定

方法見參考文獻[10]。

（2）感官評分標準

選經過訓練的10人根據感官評分標準對產品進行感官評價。評分標準（滿分為20分）如下：

A、B、C、D四種指標，分別為色澤、口感、滋味、香氣，每項滿分5分，總共20分。

A色澤：色澤呈現出蛋乳的純色4～5分，色澤過黃或偏白0～3分；B口感：口感細膩、幼滑4～5分，口感粗糙有結塊0～3分；C滋味：酸甜適中、無澀味4～5分，滋味偏淡、無明顯特點2～3分，酸甜不適、有明顯澀味0～1分；D香氣：有明顯醇香和奶香4～5分，醇香氣味較淡0～3分。

（3）酒精度的測定

方法見參考文獻[10]。

（4）膽固醇的測定

①膽固醇含量標準曲線的繪制：膽固醇及其脂類在硫酸作用下與鄰苯二甲醛產生紫紅色物質，此物質在波長550nm處有極大吸收，用比色法測定總膽固醇含量。按表2操作加入各種試劑于比色管中，在20℃～37℃靜置10min[11]。以試劑空白調零，立即于紫外可見分光光度計波長550nm處測定吸光度值，并繪制標準曲線，建立膽固醇含量與A550nm值線性回歸方程為y=0.0026x+0.0364（R2=0.9943）。

表2 標準曲線溶液的配制Table 2 Solution preparation of standard curve

②鄰苯二甲醛法測定蛋乳發酵飲料中膽固醇含量：試管中加入發酵蛋奶樣品1.00g，然后加入2mL～3mL甲醇氯仿混合液，混勻，于45℃水浴加熱15min，過濾于具塞比色管，并補充甲醇氯仿混合液至10mL。取上述樣品處理液0.4mL，然后加入1000mg/L鄰苯二甲醛0.2mL、混合酸4.0mL，在20℃～37℃靜置10min。以試劑空白（甲醇氯仿混合液0.4mL、鄰苯二甲醛0.2mL、混合酸4.0mL）調零，于波長550nm處測定樣品的吸光度值，根據線性回歸方程計算樣品膽固醇含量，再計算膽固醇的降低率。

2 結果與分析

2.1 降膽固醇蛋乳發酵飲料二次發酵條件確定

2.1.1 發酵溫度的確定

圖1 發酵溫度對產品感官品質的影響Fig.1 Effects of fermentation temperature on sensory quality of the product

酵母菌最適生長溫度一般為25℃～28℃，不同發酵溫度影響菌體產生的酒精含量，進而影響飲料感官指標[12]。由圖1可知，34℃時產品感官評分最高，口感細膩，酸甜適宜，醇香濃郁；30℃和32℃時產品口感粗糙，醇香過濃，感官評分較低；26℃和28℃時產品口味不協調，滋味偏淡，感官評分最低。

2.1.2 發酵時間的確定

圖2 發酵時間對產品感官品質的影響Fig.2 Effects of fermentation time on sensory quality of the product

不同發酵時間影響酵母菌產生的酒精含量。發酵時間過短時，產生的酒精含量較少；發酵時間過長時，會使菌體發生自溶，產生酵母臭味，導致產品風味變劣。由圖2可見，發酵24h的產品酸甜適中，醇香適宜，口味協調；20h時由于發酵時間太短，產品滋味、醇香氣味較淡；28h、32h、36h時產品口感及風味較差。

2.1.3 接種量的確定

不同接種量影響酵母菌產生的酒精含量。接種量過低，產生酒精含量較少；接種量過高，后期產生酒精含量過多，導致產品風味變劣。由圖3可知，接種量為1%時的飲料口感最好且香氣怡人，接種量為2%～5%時產品口感及風味較差。

2.2 正交試驗優化二次發酵條件

影響飲料感官指標的主要因素有發酵時間、發酵溫度、接種量等，根據R值大小可以直觀分析試驗因素的主次順序，再利用方差分析進行檢驗。由表3可知，RB＞RA＞RC，RB'＞RA'＞RC'，即發酵時間是影響產品感官指標的主要因素，發酵溫度次之，接種量影響最小。由表4、表5可見，不同發酵溫度和發酵時間對產品感官指標影響極顯著（p＜0.01），接種量對產品感官指標影響不顯著。由表4可知，KA3＞KB2＞KC1，KA3'＞KB2'＞KC1'，二次發酵條件最佳組合為A3B2C1，即發酵溫度34℃，發酵時間24h，接種量1%。在此最佳條件下，產品感官評分為18分。

圖3 接種量對產品感官品質的影響Fig.3 Effects of inoculum on sensory quality of the product

表3 蛋乳發酵飲料發酵條件優化正交試驗結果與分析Fig.3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of egg and milk beverage

2.3 產品酸度測定

由圖4可見，產品后熟前后的酸度變化不大，說明藏靈菇源乳酸菌后熟期間產酸緩慢，有助于解決產品后酸化過快，導致乳品感官質量下降及保質期短等問題，從而保證產品質量。

表4 后熟前正交試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results before post-fermentation

表5 后熟后正交試驗結果方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal experiments results after post-fermentation

圖4 產品后熟前與后熟后酸度對比Fig.4 Comparison of acidity between before and after post-fermentation

2.4 產品膽固醇和酒精度含量的測定

表6 產品膽固醇含量測定結果Table 6 Determination results of cholesterol content of the product

表7 產品酒精度測定結果Table 7 Determination results of alcoholic content of the product

由表6可知，一次發酵前、一次發酵后、二次發酵后熟前后，膽固醇含量明顯下降，說明藏靈菇源乳酸菌和酵母菌在發酵過程中代謝產生膽鹽水解酶[13-15]，從而降低了原料中的膽固醇。由于酵母菌在二次發酵過程中代謝產生大量的膽鹽水解酶，因而二次發酵后熟前比一次發酵的膽固醇含量降低了38.96個百分點；飲料后熟后的膽固醇含量比后熟前又下降了3.22個百分點，說明低溫有利于膽鹽水解酶的產生。由表7可知，產品酒精度為0.5g/100mL～1.0g/100mL，且后熟前后酒精含量變化不大，適合眾多人群飲用。

3 結論

3.1 發酵時間是影響產品感官指標的主要因素，發酵溫度次之，接種量影響最小。通過正交試驗確定二次發酵最佳條件為發酵溫度34℃，發酵時間24h，接種量1%。

3.2 通過乳酸菌一次發酵和酵母菌二次發酵，產品膽固醇含量的降低率分別為32.81%和71.77%，二次發酵后熟之后的膽固醇含量降低率為74.99%，說明藏靈菇源酵母菌M3菌株具有良好的降膽固醇作用。

3.3 產品酒精度為0.5g/100mL～1.0g/100mL，且后熟前后酒精含量變化不大，適合眾多人群飲用。產品色澤柔和，呈乳黃色，淡淡的奶香伴著醇香，口感酸甜適中，是一種集營養與保健為一體的功能性飲料。

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