α-葡萄糖苷酶的制備工藝研究進展

嚴曉娟，陳 朋，2*，梁 寧，胡先望

（1甘肅省商業科技研究所，甘肅蘭州，730010；2蘭州大學藥學院，甘肅蘭州，730020）

α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase，EC.3.2.l.20）系統命名為α-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，又名α-葡萄糖基轉移酶或麥芽糖酶，簡稱α-糖苷酶。其在糖的催化反應方面具有水解和轉糖苷雙重作用，可從α-葡萄糖苷、寡糖和葡聚糖的非還原性末端切開α-1，4糖苷鍵，釋放出葡萄糖或將游離出的葡萄糖殘基以α-1，6糖苷鍵轉移到另一個糖類底物上，從而得到非發酵性的異麥芽低聚糖（isomalto-oligosaccharides，簡稱IMO）、糖脂或糖肽等[1]。α-葡萄糖苷酶在自然界廣泛分布，種類繁多，幾乎存在于所有生物體內。在人類的糖原降解及動物、植物和微生物的糖類代謝方面具有重要的生理功能。目前，α-葡萄糖苷酶已廣泛應用于基礎和開發研究領域，主要包括生產低聚異麥芽糖、淀粉水解、酒精發酵、代謝機理研究、食品成分分析和醫學診斷等方面[2]。

不同來源的α-葡萄糖苷酶相對分子質量差異很大，一般為40000u～150000u。pH值為3.0～5.0，但最適pH值可以超過7.0；多數具有較高的熱穩定性和最適溫度，屬于鍵專一性酶，可專一性地切開糖類底物分子中的α-1，4糖苷鍵，個別種類的也可以作用于蔗糖的α-1，2糖苷鍵[3]。

1 α-葡萄糖苷酶的制備與提取

1.1 從植物中提取

植物中提取α-葡萄糖苷酶常用的方法包括醇法、水-醇法、醇吸附樹脂法、醇提-醚（酮）沉淀法、透析法、氧化鎂吸附法、葡聚糖凝膠法、大孔吸附樹脂法、硅膠柱層析法等[3]。從植物中提取α-葡萄糖苷酶的報道很少。

1.2 微生物發酵

目前，國外生產的α-葡萄糖苷酶大部分為純酶，酶活較高，而國內對α-葡萄糖苷酶的研究集中在產酶菌株的誘變選育、分離純化、固定化酶、酶學性質和基因工程菌方面[4-5]，主要以粗酶液為主，酶活較低。已開發的α-葡萄糖苷酶主要來源于黑曲霉、米曲霉、地衣芽孢桿菌和酵母，其中產酶較高的是黑曲霉[6-9]。將N+注入出發菌株誘變得到一株檸檬酸高產菌株黑曲霉LD20，將其在500L發酵罐中進行發酵實驗，在35℃、300r/min、24h的發酵條件下，α-葡萄糖苷酶最高酶活可達到322.52U/mL[10]。實際生產中的α-葡萄糖苷酶主要來源于真菌，由于真菌的發酵周期較長，酶的產量和特性不易控制，所以構建和利用基因工程菌作為生產該酶制劑的宿主，成為該酶的研究熱點。α-葡萄糖苷酶基因的來源主要集中在嗜熱菌屬、曲霉屬、芽孢桿菌屬、腸桿菌等，表達所選用的宿主大多為大腸桿菌、畢赤酵母、釀酒酵母和其他絲狀真菌等。從阪崎腸桿菌（ATCC29544）中克隆到α-葡萄糖苷酶基因malA，將其克隆入表達載體pET22b（+），構建重組表達質粒pET22b-malA。將重組表達質粒轉化大腸桿菌BL21（DE3），得到的克隆的目的基因全長1677bp，與Genbank的malA比較具有100%的同源性[11]。從腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesentcroidesATCC 8293）里克隆到編碼糖苷酶家族3保守區段的基因（Leum-0289），將該基因插入到表達載體pET28a（+）中，得到的重組α-葡萄糖苷酶具有高度的專一性，只能水解合成底物p-NPG[12]。

2 α-葡萄糖苷酶的純化

酶純化的常用方法有鹽析、有機溶劑沉淀、離子交換層析、親和層析、凝膠過濾層析、疏水層析色譜、超濾技術、聚丙烯酰胺凝膠電泳等[13]。其中，鹽析和有機溶劑沉淀常用于酶的初級純化階段，離子交換層析、親和層析、凝膠過濾層析等方法，對于酶更高級別的純化效果好，常用于重組α-葡萄糖苷酶的分離純化，同時將幾種分離純化方法結合使用，能達到更理想的分離純化效果[14]。

2.1 硫酸銨沉淀

硫酸銨沉淀法是大部分酶在初級純化階段經常采用的方法。由于硫酸銨沉淀對酶的活性損傷少，沉淀可長時間保存，又可除去大部分雜蛋白，所以目前酶初純階段大多采用硫酸銨分級沉淀，該法純化操作簡單，成本低廉，溫度系數小，不易使蛋白質變性，但是分辨力差，酶中混雜大量鹽分，純化倍數不高[15]。

2.2 冷丙酮沉淀

在冰浴條件下，向酶抽提液中邊攪拌邊加入不同體積比的冷丙酮（-15℃），根據各種蛋白質的溶解度不同，利用不同濃度的丙酮來沉淀不同的蛋白質，從而達到分離純化的目的。該法分辨率高，可除去大量的雜蛋白和色素物質。

2.3 離子交換層析

離子交換層析是以離子交換劑為固定相，依據流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法，該法靈敏度高、重復性好、選擇性強、分析速度快，被廣泛應用于酶和蛋白質的分離純化中，常用于重組α-葡萄糖苷酶的分離純化。劉軍等[16]從嗜熱棲熱菌Thermus thermophilus中克隆耐熱α-葡萄糖苷酶基因hbg及在大腸桿菌中高效表達，采用鎳親和柱-陰離子交換柱純化重組表達的α-葡萄糖苷酶，經SDS-PAGE分析表明，經誘導的重組菌有明顯的重組蛋白表達帶，純化后可見一條單一蛋白帶，預期分子量為61.798ku。郎國竣等[17]采用HD-1大孔酚醛系弱酸性陽離子交換樹脂柱層析、HZ806大孔吸附樹脂柱層析、高效液相制備色譜等對編號為506157菌株次級代謝產物的活性成分進行分離純化，得到的抑制劑純樣品純度可達95%以上。袁亞宏等[18]比較了Q-Sepharose Fast Flow和DE-52這兩種陰離子交換柱對1株Alicyclobacillus contaminans發酵產生的α-葡萄糖苷酶的分離純化效果，發現經過Q-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析柱分離效果優于DE-52層析柱。

2.4 親和層析

將具有特殊結構的親和分子制成固相吸附劑放置在層析柱中，當要被分離的蛋白混合液通過層析柱時，與吸附劑具有親和能力的蛋白質就會被吸附而滯留在層析柱中，然后選用適當的洗脫液，改變結合條件將被結合的蛋白質洗脫下來，達到分離純化的目的。該法純化能力強大，活性蛋白的回收率高，可純化其他方法難以分離的蛋白質[14]。常用于重組α-葡萄糖苷酶的分離純化。楊捷琳等[12]克隆獲得了阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶基因，通過構建pET22b（+）-Glu表達質粒轉化大腸桿菌獲得基因重組的高表達菌株，采用Ni-NTA親和柱純化目的蛋白，純化后純度達到了90%以上。

2.5 凝膠過濾層析

利用具有網狀結構的凝膠的分子篩作用，根據被分離物質的分子大小不同來進行分離。該法操作條件溫和，不需要有機溶劑，對于高分子物質有很好的分離效果。常用于α-葡萄糖苷酶的分離純化。畢金峰等[19]探討了一種黑曲霉所產α-轉移葡萄糖苷酶粗酶的分離提純方法，采用葡聚糖凝膠G2200柱層析法分離粗酶液，用SDS2聚丙烯酰胺凝膠電泳測定純酶的分子質量為130ku。

3 α-葡萄糖苷酶活性的測定

α-葡萄糖苷酶活力單位定義各異，按QB2525-2001《食品添加劑α-葡萄糖轉苷酶》，酶活定義為1mL酶制劑于40℃、pH 5.0的條件下，1h作用α-甲基-D-葡萄糖昔生成1μg葡萄糖所需的酶量定義為一個酶活力單位（U/mL）。袁亞宏等[18]研究的α-葡萄糖苷酶活的測定方法：1個酶活力單位（U）為52℃、pH 5.4條件下，1min催化產生1μmol對硝基苯酚需要的酶量。陳健旋等[20]研究的α-葡萄糖苷酶活測定方法：以每小時生成1μmol葡萄糖的酶量定義為1個單位，再測定濕固體曲水分，然后折算成U/g（干曲）表示其酶活。楊捷琳等[21]利用α-葡萄糖苷酶能夠分解4-硝基苯基-α-D-呋喃型葡萄糖的特性，在阪崎腸桿菌顯色培養基上檢測表達純化后的蛋白活性。畢金峰等[22]用直接滴定法測定α-轉移葡萄糖苷酶作用于一定濃度的底物生成產物還原糖的量，用消耗反應液體積來間接反映α-轉移葡萄糖苷酶的酶活。

4 展望

目前，國內對α-葡萄糖苷酶研究主要集中在生產菌種的誘變選育、分離純化、固定化酶、酶學性質和基因克隆表達等方面。微生物發酵是α-葡萄糖苷酶產業化的基礎，研究其生化性質、轉糖苷反應條件、純化方法，優化發酵工藝和改造酶的特異性等方面，具有重要的理論和應用價值。由于國內工業化生產α-葡萄糖苷酶的酶活很低，如何通過跨界融合技術、多重因素設計高效低成本的表達系統，研究酶的結構與功能以及酶的固定化技術，對提高α-葡萄糖苷酶的研究至關重要。

表1 微生物提取α-葡萄糖苷酶Table 1 Microbial extraction of α-glucosidas

表2 α-葡萄糖苷酶的純化方法Table 2 This methods of purification of α-glucosidas

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