發酵時間對醬渣厭氧發酵產酸的影響

齊希光，李秀芬

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 環境與土木工程學院，江蘇 無錫 214122）

僅2010年，我國就產生了約470萬t的醬渣（含水75%）。醬渣是指釀造醬油原料經制曲、發酵、淋出醬油后產生的固體殘渣。據釀造原料不同，醬渣（干基）中含有約20%～30%粗蛋白、7%～18%粗脂肪、10%以上碳水化合物、20%～24%粗纖維、8%～12%水分、0.5%～2.0%鹽分和豐富的礦物質，再利用價值很高。目前，醬渣主要是低價賣給農民用作肥料和飼料，但由于含鹽度高，用量受到限制[1]。而其回收利用和深度加工尚處于研究階段，主要集中在提取油脂、膳食纖維、黃酮和鮮味劑等成分，研究結果尚不理想。

有機廢棄物厭氧發酵會產生多種揮發性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA）如乙酸、丁酸等，可作為發酵工業原料生產高附加值的發酵產品（如角質酶）[2-3]，或作為化工原料合成其他產品[4]，或作為微生物燃料電池的底物產電[5-6]，或用于廢水脫氮除磷[7-8]。VFA的附加值遠大于甲烷，據MICHAEL KR[9]估測，1t生物質可以生產價值150美元的乙酸，但只能生產出價值31美元的甲烷[9]。發酵時間是厭氧發酵產酸的重要參數之一。首先，厭氧發酵產酸是一個三階段過程，隨著發酵時間的推進，產物會不斷轉化，戊酸、丁酸、丙酸等可能會轉化成乙酸，但乙酸也可進一步轉化為H2、CH4、CO2等；其次，產物的過度積累可能會產生反饋抑制，吉布斯自由能降低，反應不再向正方向發生；最后，厭氧微生物生長繁殖也遵循生長曲線的3個階段[10]：對數生長階段、穩定生長階段、內源呼吸階段。

目前，生物質厭氧發酵產酸的研究主要集中在污水處理廠污泥、餐廚垃圾、藍藻等的處理，而有關醬渣厭氧發酵產酸研究報道鮮見。通過優化醬渣厭氧發酵產酸的發酵時間，將醬渣中的有機成分盡可能多的轉化成乙酸等揮發性脂肪酸，可在實現醬渣減量化的同時，生產高附加值產品，是獲得良好環境和經濟效益的有效途徑。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

醬渣溶液濃度為100g/L，用4mol/LHCl和NaOH調節pH值至11.0，90℃預處理2h，離心后的上清液作為發酵產酸的底物，其中，可溶性蛋白質和碳水化合物的濃度分別為3.5g/L～5.0g/L和3.0g/L～4.0g/L。接種污泥為無錫市某污水處理廠的消化污泥，其有機物和總固體之比（VS/TS）為62.90%。將此污泥放入有效容積為2L的UASB反應器中馴化[11]，所得酸化接種污泥的VS/TS為71.21%。初始發酵pH值為9.0，發酵基質與微生物之比（F/M）比為5∶1。充3min氮氣后橡膠塞密封，放入120r/min搖床中厭氧發酵[12-13]，發酵溫度為35℃。

1.2 儀器與設備

2010 氣相色譜儀：日本島津公司；T6紫外可見光分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；FE20pH計：梅特勒托利多儀器（上海）有限公司；CR21GII高速冷凍離心機：日本日立公司；HZ-2011KC汽浴搖床：太倉市華利達實驗設備有限公司；UASB反應器：自制。

1.3 分析測試項目及方法

測定前樣品預處理：取5mL厭氧產酸發酵液，8000r/min離心5min，用0.45μm的微濾膜過濾，取濾液0.5mL于離心管中，加入同體積0.835g/L的4-甲基戊酸溶液（作為內標）和同體積3mol/L的磷酸溶液（促使溶液中的VFA在進樣室內氣化），混勻，再次8000r/min離心5min，取1mL上清液裝入氣相色譜進樣瓶，進島津2010氣相色譜儀檢測。氣相色譜測定參數：AOC-20i自動進樣器；FID檢測器；PEG-20M毛細管柱（30m×0.32mm×0.5μm）：大連中匯達科學儀器有限公司）；采用一階程序升溫，初溫80℃，保持3min后，以15℃/min的速率升至210℃，保持2min。進樣室和檢測器的溫度都設為250℃。

蛋白質含量采用考馬斯亮藍G250染色法測定[14]；碳水化合物含量采用苯酚-硫酸法測定[15]。

2 結果與討論

2.1 發酵時間對可溶性蛋白質濃度的影響

醬渣中含有占總固體20%～30%的粗蛋白，也是其預處理液中厭氧發酵產酸的重要底物，約為3.5g/L～5.0g/L，考察發酵前后蛋白質濃度的變化非常重要。發酵初期，底物與微生物發酵接觸作用時間較短，底物的利用和轉化率低，隨發酵時間延長，微生物與底物的接觸更為充分，有利于底物的代謝降解，相應地底物轉化率增大。醬渣預處理液中蛋白質濃度隨發酵時間的變化情況見圖1。

由圖1可見，蛋白質濃度隨發酵時間的延長先快速下降，后基本穩定。發酵初期，醬渣預處理液中蛋白質濃度較高，約為3.5g/L，與微生物接觸并吸收轉化的幾率大，蛋白質降解迅速，發酵2d時，蛋白質濃度就降低至1.2g/L左右，蛋白質降解率達62.52%。之后，隨蛋白質濃度的降低，與微生物接觸并吸收轉化的幾率隨之下降，降解速度逐漸平穩，發酵至第8d時，蛋白質降解率為68.60%。發酵8d后，延長發酵時間對蛋白質降解轉化的意義不大。

圖1 發酵時間對蛋白質濃度的影響Fig.1 Influence of fermentation time on protein concentration

2.2 發酵時間對可溶性碳水化合物濃度的影響

醬渣中碳水化合物的含量在10%以上，其醬渣預處理液中的濃度約為3.0g/L～4.0g/L，相對而言，又易被微生物吸收利用，是厭氧發酵產酸的良好底物。可溶性碳水化合物濃度隨發酵時間的變化規律見圖2。

圖2 發酵時間對碳水化合物濃度的影響Fig.2 Influence of fermentation time on carbohydrate concentration

由圖2可見，與醬渣中蛋白質濃度的變化類似，隨發酵時間的延長，碳水化合物濃度同樣是先迅速降低，再呈平穩下降的趨勢。在發酵初期，因可溶性碳水化合物濃度高，易與微生物接觸并消化吸收，降解迅速，其濃度在2d內由2.90g/L降低為0.90g/L，碳水化合物濃度下降迅速，其降解率達68.33%。之后濃度趨于平穩，發酵至第8d時，碳水化合物降解率為81.21%，之后，降低不明顯。另外，碳水化合物比蛋白質更易被產酸微生物降解利用，在相同條件下，其轉化率比蛋白質高出約10個百分點，高濃度的可溶性碳水化合物有利于厭氧發酵產酸。

2.3 發酵時間對厭氧發酵末端產物濃度的影響

厭氧發酵末端產物的分布主要取決于各個生態因子綜合作用下占主導地位的微生物種群的獨立代謝途徑，即一旦環境條件適于某一種群，該種群就會迅速占據主導地位，其生理代謝就決定了發酵末端產物的類型[16]。VFA是酸化階段的主要產物，乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸可直接由碳水化合物及蛋白質發酵獲得，更高分子量的揮發性脂肪酸，如正戊酸和異戊酸等主要由蛋白質發酵獲得，因為對不含蛋白質的底物進行酸化研究發現，不生成正戊酸和異戊酸。醬渣預處理液厭氧發酵產酸分布隨發酵時間的變化情況見圖3。可以看出，末端發酵產物分布隨發酵時間的延長先增加后降低，發酵產物包括乙醇、乙酸、丙酸、異丁酸、正丁酸、戊酸等。發酵至第8d時，總發酵末端產物濃度最高，為28.82g/L，相應地，乙酸濃度也在此時達最大，為22.91g/L。之后，隨發酵時間持續延長，有機酸濃度轉而下降，至第22d時，總酸濃度降低到2.10g/L。結合圖1和圖2中可溶性蛋白質及碳水化合物濃度隨發酵時間的變化規律，可知，當蛋白質和碳水化合物濃度較低時，有機酸被微生物作為基質再利用，其濃度開始迅速下降。因此，從厭氧產酸的角度，8d的發酵時間較為合適。

另外，除乙酸外，相對于其他有機酸，無論在什么發酵時間，厭氧產酸過程中均存在明顯的丙酸累積現象，發酵8d時丙酸累積量最高，約為5.00g/L。在厭氧產甲烷過程中，也常出現丙酸累積現象。有機物的厭氧消化主要是在水解發酵產酸菌群、產氫產乙酸菌群和產甲烷菌群等不同微生物類群的協同作用下逐步完成的。其中，產氫產乙酸菌群將產酸發酵菌群代謝產生的丙酸、丁酸、乙醇等轉化為乙酸、氫氣和二氧化碳。然而，從生化反應的能量學角度分析，丙酸的產氫產乙酸代謝是所有VFA厭氧氧化中最難發生的反應，因在標準狀態下，丙酸被轉化為乙酸反應的吉布斯自由能達76kJ/mol[17]，為正值，不能自發進行，因此，丙酸常在厭氧消化系統中累積[18]。

圖3 發酵時間對厭氧酸化產物濃度及分布的影響Fig.3 Influence of fermentation time on the concentration of anaerobic acidogenic products and their distribution

2.4 發酵時間對乙酸百分比的影響

乙酸可作為微生物燃料電池的底物產電，乙酸還可化學合成醋酸乙烯，醋酸乙烯是合成工業塑料的單體，也可化學合成醋酸纖維素，再進一步轉化為乳膠涂料、色素等，是重要的化工原料。因此，通常希望厭氧發酵產生的有機酸以乙酸為主。乙酸百分比隨發酵時間的變化情況見圖4。

圖4 發酵時間對乙酸百分含量的影響Fig.4 Influence of fermentation time on the percentage of acetic acid

由圖4可見，在整個發酵過程中，乙酸都是主要發酵末端產物，占總末端發酵產物比例較高，在60%～80%左右，總體隨發酵時間的增加而增加，后趨于穩定，發酵8d時，乙酸占總有機酸的比例達到最大，為79.49%。因此，發酵時間8d最優。

3 結論

（1）醬渣預處理液中可溶性蛋白質和碳水化合物濃度隨發酵時間延長，先快速降低后逐步趨緩，發酵8d后基本穩定。發酵初期，可溶性蛋白質和碳水化合物等主要產酸有機底物迅速降解轉化，發酵2d時其降解率分別為62.52%和68.33%，第8d時則分別為68.60%和81.21%。相對而言，可溶性碳水化合物是較好的發酵產酸底物。

（2）隨發酵時間延長，發酵產生的總有機酸和乙酸濃度先增加后降低，并在第8d時取得最大值，分別為28.82g/L和22.91g/L，在可溶性底物被逐步消耗時，所產有機酸被微生物作為底物吸收再利用。乙酸是主要產物，占總酸比例為79.49%。厭氧產酸過程中存在一定量的丙酸累積現象，發酵8d時丙酸累積量最高，約為5.00g/L。

[1]閻 杰.釀造醬渣開發利用的研究進展[J].中國釀造，2007，26（2）：5-8.

[2]朱曉宇，陳銀廣.資源化利用污水廠剩余污泥產生的鍛煉脂肪酸的研究進展[J].水處理技術，2010，10：1-4.

[3]JIANG Y M,CHEN Y G,ZHENG X.Efficient polyhydroxyalkanoates production from a waste-activated sludge alkaline fermentation liquid by activated sludge submitted to the aerobic feeding and discharge process[J].Environ Sci Technol，2009，43（20）：7734-7741.

[4]沈菊華.國內外醋酸生產應用及市場分析[J].石油化工技術經濟，2003，19（6）：26-30.

[5]LIU H,CHENG SA,LOGAN BE.Production of electricity from acetate or butyrate using a single-chamber microbial fuel cell[J].Environ Sci Technol，2005，39（2）：658-662.

[6]趙 娟，吳瑾妤，李秀芬，等.基于底物類型的微生物燃料電池的產電特性[J].食品與生物技術學報，2010，29（4）：629-633.

[7]佟 娟.剩余污泥堿性發酵產生的鍛煉脂肪酸作為生物脫氮除磷碳源的研究[D].上海：同濟大學，2008.

[8]TONG J,CHEN Yg.Enhanced biological phosphorus removal driven by short-chain fatty acids produced from waste activated sludge alkaline fermentation[J].Environ Sci Technol，2007，41（20）：7126-7130.

[9]MICHAEL K R.Production of acetic acid from waste biomass[M].USA:Texas A&M University，1998.

[10]周群英，王士芬.環境工程微生物學[M].北京：高等教育出版社，2008.

[11]劉曉玲.城市污泥厭氧發酵產酸條件優化及機理研究[D].無錫：江南大學博士論文，2008.

[12]CHEN YG,JIANG S,YUAN HY,et al.Hydrolysis and acidification of waste activated sludge at different pHs[J].Water Res，2007，41（3）：683-689.

[13]FENG L Y,CHEN Y G,ZHENG X.Enhancement of waste activated sludge protein conversion and volatile fatty acids accumulation during waste activated sludge anaerobic fermentation by carbohydrate substrate addition：the effect of pH[J].Environ Sci Technol，2009，43（12）：4373-4380.

[14]BRAFORD M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein dye binding[J].Anal Biochem，1976，72（1-2）：248-25.

[15]DUBPIS M,GILLES K A,HAMILTON J K,et al.Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J].Anal Biochem，1956，28（3）：350-356.

[16]任南琪，王愛杰.厭氧生物技術原理與應用[M].北京：化學工業出版社，2004.

[17]夏 濤，陳立偉，蔡天明，等.硫酸鹽還原菌促進厭氧消化中丙酸轉化的研究[J].環境科學與技術，2009，32（5）：40-43.

[18]GALLERT C,WINTER J.Propionic acid accumulation and degradation during restart of a full-scale anaerobic biowaste digester[J].Bioresource Technol，2008，99（1）：170-178.