硝酸鹽對畜糞秸稈體系厭氧發酵產沼氣的影響

謝 婷，饒康太，陳 雄，高順清，魯 江，王 志*

（1.湖北工業大學，湖北 武漢 430068；2.深圳華潤九新藥業有限公司，廣東 深圳 518049）

農業廢棄物的增益化利用是循環生態農業非常重要的環節，隨著我國農業的發展，每年7億t的作物秸稈產量和預計到2020年將達到42億t的畜糞年排放量成為生態農業資源化利用以及可持續發展亟待解決的問題和研究熱點[1]，如秸稈、畜糞等農業廢棄物在厭氧條件下轉化為沼氣的研究[2-3]。雖然秸稈中存在纖維素和木質素等分子形成的特殊結構[4]和木質素芳環降解物對厭氧菌群的毒性[5]以及畜糞秸稈厭氧體系易于“基質酸化”等而使沼氣產量的穩定性降低[6]，但是纖維素、木質素等大分子還是可以被厭氧耦合菌系有效降解[7]。“基質酸化”從本質上是厭氧體系細菌發酵產生的乙酸等小分子有機酸的能力大于甲烷菌群利用其為碳源和能源來合成甲烷的能力所造成[8]，因此可以通過大量補加產甲烷菌[9]和向酸化體系中補加能利用畜糞厭氧產氨的細菌[10]來緩解碳代謝失衡而降低酸化程度，但是由于兩者純培養的技術難度妨礙了其大規模應用。

厭氧條件下，多數兼性厭氧菌（如芽胞桿菌、大腸桿菌、糞產堿菌、假單胞菌等）能將有機物氧化放出的電子傳遞給硝酸鹽同時釋放能量[11]。當沒有硝酸鹽或其可獲得性不足時，兼性細菌可通過發酵作用將電子直接傳遞給中間產物，產生乙酸等小分子有機酸，而其在厭氧體系中被甲烷菌系利用而產生甲烷。當該代謝耦合作用失衡時，酸化由此產生[8，12]。因此，硝酸鹽的可獲得性可能成為緩解或解決秸稈畜糞厭氧體系產沼氣系統酸化的易行方法。本文在秸稈畜糞厭氧發酵體系中添加硝酸鹽和兼性產氨菌株，考察其對厭氧發酵過程中基質利用、體系pH值和揮發性脂肪酸（VFA）代謝以及沼氣產量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 發酵原料

水稻秸稈（含水率小于10%），粉碎后過40目篩后備用。新鮮牛糞（總固形物含量TS為15.6%）或/和豬糞（總固形物含量TS為13.9%）。

1.1.2 實驗裝置

采用橡膠塞封口的250mL抽濾瓶作為反應器，出氣口連接橡膠管并浸沒固定于15%NaOH溶液的量筒內。抽濾瓶位置高于量筒，以免倒吸。反應器置于37℃恒溫水浴鍋中。

1.2 方法

1.2.1 發酵體系裝配

自然厭氧發酵體系：5g秸稈粉裝入250mL的抽濾瓶中，添加牛糞或/和豬糞（牛糞和豬糞混合時，其比例為2∶1）30g，加蒸餾水200mL后立即將瓶口用橡膠塞封閉，出氣橡膠管固定于集氣裝置。

以兼性氨化菌為接種物的秸稈畜糞發酵體系：5g秸稈粉裝入250mL的抽濾瓶中，添加牛糞和豬糞（混合比例2∶1）30g，接入在LB液體培養基中活化12h的兼性厭氧氨化菌——糞產堿菌（Af）或/和蘇云金芽孢桿菌（Bt）30mL（Af生物量為1.6g/L，Bt生物量是1.8g/L），再加蒸餾水170mL后立即將瓶口用橡膠塞封閉，出氣橡膠管固定于集氣裝置。

1.2.2 分析檢測方法

產沼氣量檢測：采用水壓法收集發酵產生的氣體，根據排出的15%NaOH溶液的體積定時記錄產氣量。

發酵液pH值：用pH值計測定。

揮發性脂肪酸（VFA）的檢測參照文獻[13-14]的方法進行。

每組試驗數據取3次重復實驗的平均值。

2 結果與分析

2.1 秸稈畜糞（牛糞或/和豬糞）體系發酵產氣及體系pH值情況

秸稈畜糞（牛糞或/和豬糞）體系自然發酵產氣過程和最終pH值見圖1、圖2。

秸稈畜糞（牛糞或/和豬糞）體系自然發酵厭氧培養168h后培養體系的產氣趨勢基本相似，產氣量隨培養時間的延長而提高。牛糞、豬糞和牛糞/豬糞體系平均產氣速率分別為0.68mL/h、1.31mL/h和1.22mL/h，后兩者產氣效率比前者分別提高了93%和79%。這與后兩者所含成分比牛糞更富營養有關。如所分析的那樣，三者在厭氧發酵過程中均發生了嚴重的酸化現象，三者的最終pH值為5.1～5.6。產氣速率與pH值之間存在對應關系，酸效應的存在使得體系產氣效率下降。新鮮牛糞中含纖維質比較多，而豬糞因含較多的蛋白類組分而緩解基質酸化的程度，提高了菌群甲烷合成能力。但是，體系酸化仍然發生了。以牛糞體系pH值最低（5.13），豬糞和牛糞/豬糞體系pH值差異不大，在5.5左右。由于研究目標是秸稈畜糞體系，因此選擇牛糞/豬糞（2∶1）作為發酵體系底物之一。

圖1 不同畜糞對體系厭氧發酵產沼氣的影響Fig.1 Effect of straw and manure anaerobic fermentation system on the biogas production

圖2 不同畜糞對體系厭氧發酵pH值的影響（平均值±標準偏差）Fig.2 Effect of straw and manure anaerobic fermentation system on pH value(Means±standard deviation)

基于對體系酸化機制的理解，通過補加前期篩選的兼性產氨細菌——糞產堿菌（Af）和蘇云金芽胞桿菌（Bt，同時接種2株菌的接種比例為1∶1）以觀察其對體系pH值和產氣的影響。

2.2 兼性氨化菌對秸稈畜糞體系發酵產氣及體系pH值的影響

體系接種糞產堿菌或/和蘇云金芽胞桿菌，秸稈畜糞體系厭氧發酵最終產氣量和pH值見圖3、圖4。

接種糞產堿菌或/和蘇云金芽胞桿菌，秸稈畜糞體系厭氧發酵168h的產氣趨勢基本相似，產氣量隨培養時間的延長而提高，產氣速率先加快，后逐漸減慢，最終產氣量分別為205mL、195mL和220mL，后者分別比前兩者提高了7.2%和12.8%。

圖3 接種兼性氨化菌對秸稈畜糞體系發酵產氣的影響Fig.3 Effects of facultative ammonifying bacteria addition on biogas production in the anaerobic straw and manure fermentation system

圖4 兼性氨化菌對秸稈畜糞體系pH值的影響（平均值±標準偏差）Fig.4 Effects of facultative ammonifying bacteria addition on pH value in the anaerobic straw and manure fermentation system(Means±standard deviation)

添加糞產堿菌或/和蘇云金芽胞桿菌菌液后體系pH值不同，其中同時添加糞產堿菌和蘇云金芽胞桿菌體系的pH值最高，為5.83。添加糞產堿菌或蘇云金芽胞桿菌的pH值相當，分別為5.70和5.76，均低于同時添加2種菌體系的pH值。

和圖2相比，接種兼性氨化菌的厭氧發酵體系的pH值均高于自然厭氧發酵體系的pH值，提高了2.9%～13.6%，可見接種兼性氨化菌有利于提高體系pH值，但pH值的緩沖效果仍然不理想，pH值仍在6.0以下。

由于在厭氧條件下，兼性厭氧菌如糞產堿菌和芽胞桿菌等能通過硝酸鹽呼吸來產生能量[11]及可能降低或緩解發酵產酸效應。因此，選擇牛糞/豬糞（2∶1）和接種兼性產氨細菌——糞產堿菌和蘇云金芽胞桿菌為基本厭氧體系，觀察硝酸鹽和氨化菌接種量對體系pH值的影響。

2.3 硝酸鉀對秸稈畜糞接種氨化菌體系發酵產氣及體系pH值的影響

由于硝酸鉀、氨化菌的復合作用可能調節體系厭氧發酵的pH值，穩定體系產氣效率，因此，對兩者進行了初步優化見表1。Af/Bt指糞產堿菌和芽胞桿菌接種菌液體積比例。

表1 加硝酸鉀和氨化菌對pH值的影響Table 1 Effects of potassium nitrate and ammoniation bacteria additions on pH value

表2 雙因素方差分析（α=0.05）Table 2 Variance analysis of two factor(α=0.05)

從表1可以看出，相同氨化菌接種比例時，體系pH值基本上都是隨著硝酸鉀添加濃度的增大而提高。硝酸鉀濃度是1g/L和3g/L時，pH值基本上不隨氨化菌接種比例的變化而變化。最優組合方案是：2g/L硝酸鉀以及糞產堿菌/蘇云金芽孢桿菌為1∶2。此條件下，體系最終pH值最高，為7.12。

由表2可知，運用Excel方差分析當α=0.05時，硝酸鉀對體系pH值影響極為顯著。氨化菌只是具有厭氧硝酸鹽呼吸的能力，但是，當培養環境中硝酸鹽的可獲得性不足時，氨化菌并不能誘導并表現出硝酸鹽呼吸的功能，因而其單獨使用的緩沖pH值效果并不明顯。

最優組合方案條件下體系產氣和pH值的情況見表3。

表3 硝酸鉀對秸稈畜糞接種兼性氨化菌體系發酵產氣及體系pH值的影響Table 3 Effects of nitrate addition on biogas production and pH value in straw manure inoculated with the facultative ammoniation bacteria system fermentation

由表3可知，優化條件下厭氧發酵168h的產氣量為350mL，比對照組（只添加氨化菌）顯著提高了62.8%。培養結束時優化組VFA含量為2.54g/L，比對照減少了13.0%。這也反映出更多的揮發性有機酸被甲烷菌群利用了，體系VFA的降低顯著緩沖了體系的pH值，發酵結束時，添加組pH值為7.12，比對照提高了22.8%。同時也表明：秸稈畜糞厭氧體系產沼氣的限制性因子不是體系VFA的生成效率，而是VFA積累到臨界濃度以上所造成的過低pH值。

硝酸鉀的加入使兼性厭氧菌群（包括糞產堿菌和芽胞桿菌）在厭氧體系的電子受體可獲得性增加，實現了電子由VFA合成途徑向硝酸鹽呼吸的代謝遷移[15-16]，緩沖了體系pH值，提高了厭氧菌系的代謝活性，促進了有機物向沼氣轉化的效率。

3 結論

秸稈畜糞（牛糞或/和豬糞）體系厭氧發酵過程發生了基質酸化現象，最終pH值為5.2～5.5，雖然接種兼性氨化菌的厭氧發酵體系比自然厭氧發酵體系的pH值提高了2.9%～13.6%，但體系pH值仍在6.0以下。當硝酸鉀的添加量為2g/L以及氨化菌（糞產堿菌/蘇云金芽胞桿菌的接種比例為1∶2）時，厭氧發酵168h的產氣量為350mL，比對照組（只添加氨化菌）顯著提高了62.8%，此時VFA含量為2.54g/L，比對照減少了13.0%。這也反映出更多的揮發性有機酸被甲烷菌群利用了，體系VFA的降低顯著緩沖了體系的pH值，發酵結束時，添加組pH值為7.12，比對照提高了22.8%。

硝酸鉀對體系pH值影響極為顯著，而氨化菌只是具有厭氧硝酸鹽呼吸的能力，但是，當培養環境中硝酸鹽的可獲得性不足時，氨化菌并不能誘導并表現出硝酸鹽呼吸的功能，因而其單獨使用的緩沖pH值效果并不明顯。硝酸鉀的加入提高了體系pH值和厭氧菌系的代謝活性，促進了有機物向沼氣轉化的效率。同時也說明秸稈畜糞厭氧體系產沼氣的限制性因子不是體系VFA的生成效率，而是VFA積累到臨界濃度以上所造成的過低pH值。

本研究結果為秸稈畜糞體系厭氧條件下因“基質酸化”而使沼氣產量降低矛盾的解決提供了一種易行策略。

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