誘導(dǎo)激活劑對(duì)不同曲霉菌株淀粉酶組分的激活作用

張賀迎，徐新霞，任 磊，武金霞*

（1.河北大學(xué) 生物技術(shù)研究中心，河北 保定 071002；2.河北大學(xué) 生命科學(xué)院，河北 保定 071002）

醬油是中國(guó)傳統(tǒng)的釀造調(diào)味品，是釀造微生物多種酶系協(xié)同作用于物料的結(jié)果。釀造微生物在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中會(huì)分泌蛋白酶、淀粉酶、果膠酶等多種酶系，這些酶的活力、含量及比例影響醬油的產(chǎn)量和質(zhì)量[1-2]。氨基酸態(tài)氮目前仍是衡量醬油釀造質(zhì)量和產(chǎn)量的重要指標(biāo)，在研究和生產(chǎn)中，常以米曲霉蛋白酶活力高低衡量菌株性能和跟蹤醬油釀造過(guò)程[3-4]。但醬油是集色、香、味、體于一體的調(diào)味品，醬色是衡量醬油感官質(zhì)量的重要組成部分，其形成主要依賴(lài)于非酶促褐變反應(yīng)，即醬醪中的蛋白質(zhì)原料、淀粉質(zhì)原料及其分解產(chǎn)物氨基酸、單糖類(lèi)等物質(zhì)在一定條件下發(fā)生美拉德化學(xué)反應(yīng)[5-7]。

淀粉酶是指能催化淀粉轉(zhuǎn)化成葡萄糖、麥芽糖及其他低聚糖的所有酶的總稱(chēng)，在醬油色、香、味、體的形成中起重要作用[8]。成曲中淀粉酶的組成及活力對(duì)醬油的品質(zhì)有重要的影響[9]。

米曲霉（Aspergillusoryzae）和黑曲霉（Aspergillusniger）是釀造醬油制曲的重要微生物，不同菌株具有自身的特性。本實(shí)驗(yàn)室發(fā)明的激活釀造技術(shù)能提高醬油產(chǎn)量和質(zhì)量，縮短發(fā)酵周期[10-13]。研究誘導(dǎo)激活劑對(duì)菌株淀粉酶組分及活性的影響，為了解誘導(dǎo)激活劑對(duì)不同菌株的激活特異性及淀粉酶在醬油釀造中的作用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

米曲霉（Aspergillus oryzae）滬釀3.042、米曲霉3.362、米曲霉HL、米曲霉ZH、米曲霉3042KG；黑曲霉（Aspergillus niger）滬釀3350、黑曲霉3.324。

豆粕麩皮固體培養(yǎng)基；Tris，可溶性淀粉，SDS，TritonX-100，丙烯酰胺及甲叉雙丙烯酰胺等。

1.2 主要儀器和設(shè)備

BG-Power 600電泳儀（BAYGENE），電泳槽（北京六一儀器廠(chǎng)，24D），凝膠成像儀Bio-Best 300M（SIM INTERNATION），水浴鍋，SH-5磁力攪拌器（BeiDe）。

1.3 方法

1.3.1 醬油成曲浸提液的制備

[14]，制備成曲浸提液。

1.3.2 淀粉酶活力測(cè)定

參考文獻(xiàn)[15]，采用DNS顯色法測(cè)定淀粉酶活力，酶活力單位定義為：在pH5.6檸檬酸緩沖液，溫度為4.0℃的條件下，5min內(nèi)水解20mg淀粉產(chǎn)生1mg麥芽糖的酶量為一個(gè)酶活力單位，以U表示。

1.3.3 Starch-PAGE檢測(cè)浸提液淀粉酶組分?jǐn)?shù)量及活性比例分析

參考文獻(xiàn)[14]作相應(yīng)的改進(jìn)，使用凝膠成像分析軟件Quantity One_v4.4.0.36分析膠中各條帶組分的活性比例。

2 結(jié)果

2.1 誘導(dǎo)激活劑對(duì)各菌株淀粉酶組分的影響

圖1 各菌株淀粉酶活性電泳圖譜Fig.1 Electropherogram of amylase activity of each strain

由圖1可知，（1）7個(gè)曲霉菌株成曲浸提液的淀粉酶組分?jǐn)?shù)量不同，黑曲霉滬釀3350、黑曲霉3.324、米曲霉3.362和米曲霉HL均含有4個(gè)淀粉酶組分，而米曲霉3.042和米曲霉3042KG含有3個(gè)淀粉酶組分，米曲霉ZH含有2個(gè)淀粉酶組分。（2）對(duì)于每一個(gè)菌株而言，誘導(dǎo)激活劑沒(méi)有改變淀粉酶組分的數(shù)量，只提高了不同淀粉酶組分的活力，進(jìn)而提高了總淀粉酶活力。（3）將含有4個(gè)組分的黑曲霉滬釀3350、黑曲霉3.324、米曲霉3.362和米曲霉HL的組分按遷移率由小到大編號(hào)為1、2、3和4，比較7個(gè)菌株淀粉酶組分的遷移率。可見(jiàn)，米曲霉滬釀3.042和米曲霉3.042KG顯示3個(gè)淀粉酶組分，分別與組分2、3、4對(duì)應(yīng)，而米曲霉ZH顯示2個(gè)淀粉酶組分，分別與組分2、3對(duì)應(yīng)。此外，從淀粉酶條帶的透明度分析，組分2是7個(gè)菌株中活力最高的組分，在醬油釀造淀粉類(lèi)物質(zhì)的降解中可能起主要作用。（4）誘導(dǎo)激活劑對(duì)7個(gè)菌株不同淀粉酶組分的誘導(dǎo)激活作用不同。對(duì)米曲霉滬釀3042的組分4、黑曲霉滬釀3.350的組分4、黑曲霉3.324的組分1、米曲霉HL的組分1和3、米曲霉ZH的組分3、米曲霉3.042KG的組分2和3均有較強(qiáng)的激活作用。

2.2 誘導(dǎo)激活劑對(duì)各菌株淀粉酶總活力的影響

由圖2可知，添加誘導(dǎo)激活劑以后，各菌株的總淀粉酶活力均有提高，但是由于不同菌株的不同淀粉酶組分對(duì)激活劑的敏感性不同（見(jiàn)圖1），導(dǎo)致不同菌株總淀粉酶活力的提高程度不同，7個(gè)菌株的淀粉酶活力提高分別為15.55%、9.64%、5.42%、14.55%、14.77%、11.14%、15.24%。

3 討論

米曲霉3.362、HL、ZH、3.042KG是在米曲霉滬釀3.042傳代過(guò)程中分離出的變異菌株，已經(jīng)應(yīng)用于醬油工業(yè)生產(chǎn)，經(jīng)過(guò)變異后的各菌株在淀粉酶組分構(gòu)成和活力分布上也發(fā)生了變化。黑曲霉3.350和3.324廣泛用于制醋工業(yè)，2菌株的淀粉酶活力高于米曲霉菌株（圖2），但對(duì)激活劑的敏感性較米曲霉菌株差。本研究通過(guò)活性PAGE直觀(guān)觀(guān)察到各菌株淀粉酶組分及活性差異，對(duì)進(jìn)一步研究誘導(dǎo)激活劑對(duì)不同菌株在醬油生產(chǎn)的作用打下了基礎(chǔ)。

圖2 激活對(duì)各菌株淀粉酶活力的影響Fig.2 Effect of activation on amylase activity of each strain

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