一株新高產黑色素海洋細菌DH166的鑒定和發酵條件研究

郭亦玲，王曉磊，李碧園，王凱迪，劉 敏，杜宗軍*

（山東大學（威海），山東 威海 264209）

黑色素（melanin）是一種廣泛存在于動植物和微生物中的非均質的類多酚聚合體，具有復雜結構，可呈現紅色、褐色及黑色。微生物產生的黑色素主要分為壁（膜）結合黑色素和胞外黑色素。黑色素通常不溶于水、酸溶液和普通有機溶劑。研究表明，這種色素對于生物的生長、發育并非必不可少，但是卻能提高生物的生存和競爭能力，可以為生物體抵抗紫外線和電離輻射、抗氧化、結合金屬離子，減少其對生物體的傷害，具有廣泛的開發應用潛力[1-2]。黑色素應用廣泛，但是許多合成色素對人體有一定的危害性，有的甚至有致癌作用，于是天然色素因其使用安全性越來越收到青睞[3]。產黑色素細菌資源較豐富，便于操作，且細菌黑色素一般是由體內的酪氨酸酶催化酪氨酸，然后再經一系列氧化過程而形成，屬于氨基酸的衍生物，具有無毒、無害、產品穩定性好的特點，因此研究微生物產生黑色素具有很大的優勢，越來越得到廣泛重視。本文對一株高產黑色素菌株DH166的分類以及產胞外黑色素特性進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

細菌DH166由本實驗室分離自東海大陸架中部海域，50m深水層處。

1.2 培養基

2216 海洋細菌培養基：蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸鐵0.01g，瓊脂15g，陳海水1000mL，pH 7.2～7.6。

牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏5g，蛋白胨5g，陳海水1000mL，pH 7.4。

酪氨酸培養基：葡萄糖1g，蛋白胨5g，牛肉膏5g，CaCl20.1g，L-Tyr2g，陳海水1000mL，pH 7.0。

5#培養基[4]：葡萄糖1g，（NH4）2SO45g，L-Tyr2g，陳海水1000mL，pH 7.0。

1.3 菌種鑒定

1.3.1 革蘭氏染色及形態觀察

根據文獻所述方法[7]，對DH166進行革蘭氏染色，鞭毛染色，芽孢染色和運動性觀察等。

1.3.2 生理生化鑒定

需鹽性試驗、生長溫度試驗、氧化發酵試驗，過氧化氫酶、明膠酶、淀粉酶、檸檬酸鹽利用等實驗按照文獻進行[8-9]。

1.3.3 16 S rDNA序列測定和分析[6]

將細菌接種在平板上，28℃培養過夜。取單一菌落懸浮于50μL無菌蒸餾水中，于100℃水浴加熱5min，離心，取上清作為PCR模板DNA。

擴 增 16SrDNA 基 因 的 正 向 引 物 為 27F：5’-AGAGTTTGATC（C/A）TGGCTCAG-3’（對應于E.coil16S rDNA基因的第8～27個堿基位置），反向引物1492R：5’-TACGG（C/T）TACCTTGTTACGACTT-3’（對應于E.coli16S rDNA基因的第1492～1510個堿基位置）。在100μL的PCR反應體系中含有：1×PCR緩沖液，1.5mmol/L MgC12，4×dNTP混合物各200μmol/L，引物各0.5μmol/L，Taq DNA聚合酶1μL（5U/μL），2μL DNA 原液。PCR反應條件為96℃預變性6min；接94℃變性1min，50℃復性lmin，72℃延伸2min，30個循環；最后72℃溫育6min。PCR擴增產物經電泳檢測后，直接交由上海生工生物工程技術公司進行純化和序列測定。

將測定的基因序列輸入Genbank，獲得收錄號。并運用Blast程序與數據庫中已存在的細菌16S rDNA基因序列進行相似性比較分析。

1.4 黑色素的提取

黑色素的提取和初步純化參照文獻的方法[5]：將菌株接種于Tyr發酵培養基，28℃搖床培養72h，發酵液過濾離心后，用鹽酸調節上清液pH值為2～3，靜置過夜，12000r/min離心，將沉淀100℃烘干，即得到黑色素粗品。

1.5 黑色素的吸收光譜

取發酵液30mL 5000r/min離心15min，沉淀中加入丙酮5mL，混勻后，冰浴條件下超聲裂解，補加丙酮15mL，5000r/min離心5min，上清液即為色素萃取液。以丙酮為空白組，使用8453E分光光度系統對色素萃取液進行全波段掃描，得到該色素的吸收峰。

2 結果與分析

2.1 培養特性

DH166在海水配制的牛肉膏蛋白胨培養基上生長良好，菌落呈黑色，表面光滑，直徑2mm～3mm，由于細菌向培養基中分泌色素，菌落周圍的培養基呈現黑色。在2216海洋細菌培養基上可以生長，但不如在牛肉膏蛋白胨培養基上生長旺盛。在酪氨酸培養基中，可以觀察到細菌向周圍的培養基中分泌大量的黑色色素，培養基中添加酪氨酸對于色素的產量具有明顯的促進作用（見圖1）。在5#培養基上生長非常微弱，初步分析是由于培養基營養成分不夠豐富。

圖1 細菌DH166在酪氨酸培養基中的生長情況Fig.1 Growth of DH166 on tyrosine medium

2.2 形態觀察及生理生化鑒定

形態觀察及生理生化鑒定的結果（見附表）。DH166為革蘭氏陰性桿狀菌，極生鞭毛，有運動性，未觀察到芽孢產生。在對DH166進行培養的過程中發現，細菌DH166的生長需要豐富的營養條件。如果培養基中不添加蛋白胨和牛肉膏一類含各種有機物的營養成分，菌株的生長就非常微弱。①21℃培養生長緩慢，產黑色素的效果也不是很好。25℃生長快，產黑色素效果好，28℃生長快，但是產黑色素效果似乎不如25℃條件下好。②DH166生長要求條件比較高。在2216E培養基上可以生長，但總起來講長得不是多好。在添加牛肉膏的培養基比2216E培養基中，細菌的生長狀況更好。此外，細菌在固體培養基中的生長比液體培養基好。進行了細菌DH166唯一碳源利用的實驗，在僅有無機鹽構成的培養基中，分別添加了葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖等多種糖類，結果發現，在不添加營養豐富的有機物的情況下，DH166在這些培養基中都不能夠生長。

附表 DH166的形態及生理生化特征Attached table Morphology,the physiological and biochemical characters of DH166

2.3 16S rDNA序列測定和分析

按上述方法進行序列擴增，擴增所得序列送往上海桑尼生物科技有限公司進行序列測定，得到核苷酸序列。16S rDNA序列提交至Genebank，獲得收錄號：DQ493656。DH 166在前述各種培養基上均有生長，菌落呈黑色，表面光滑。過氧化氫酶、明膠酶、卵磷脂酶、氧化酶、硝酸鹽還原陽性，淀粉酶、檸檬酸利用、V.P反應、甲基紅反應、H2S產生、葡萄糖產氣、精氨酸雙水解等陰性，O/F試驗發酵產酸，綜合16S rDNA序列分析結果，可初步確定該菌屬于假交替單胞菌屬。

2.4 黑色素的提取鑒定與吸收光譜

DH166液體培養物136mL，按文獻方法得177mg黑色素粗提物，即130mg/100mL。

按上述方法獲得DH166的吸收光譜（見圖2），由圖2可知，其最大吸收峰位于波長232nm處。此次分離出的DH 166產黑色素產量高，達130mg/100mL，即1.3g/L，并且大量向培養基內分泌，經酪氨酸誘導可顯著提高其胞外黑色素的產量，而文獻報道的最高產量為0.60g/L，且不具酪氨酸誘導的特點[4]。

圖2 DH166的吸收光譜Fig.2 DH166 absorption spectrum

3 結論

從東海大陸架中部海域50m深水層處分離獲得一株產黑色素的菌株DH166，通過菌體形態特征觀察、生理生化鑒定和系統發育學分析，初步鑒定DH 166菌種屬于假交替單胞菌屬。

海洋具有高壓、高鹽、低營養、低溫、無光照等獨特的環境，這些特殊的環境使得海洋微生物的種類更加多樣，代謝途徑更加復雜，初級代謝產物和次生代謝產物種類也更為繁多、結構更加新穎，可能產生完全不同于陸地微生物的新型生物活性物質。目前有關海洋細菌生產黑色素的研究還很少，對于海洋細菌所產黑色素的性質是否與陸地細菌所黑色素相一致、黑色素對海洋細菌本身的生態學意義以及該黑色素是否具有其它生物活性還有待于進一步深入研究[13]。由于該菌種產黑色素快，產量高，約為1.3g/L，且大量向培養基內分泌，易于分離，因此DH 166菌種有望成為一類新的黑色素生產菌種。

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