錦州蝦油小黃瓜中耐鹽乳酸菌的生物性能研究

白鳳翎，劉邑娥，馬 馳，李 瑩，呂欣然，石金鑫，勵建榮

（渤海大學 化學化工與食品安全學院，遼寧省食品安全重點實驗室“，食品貯藏加工及質量安全控制工程技術研究中心”遼寧省高校重大科技平臺，遼寧 錦州 121013）

錦州蝦油小黃瓜是由遼西地區特有的頂花帶刺的小黃瓜用錦州地區特制的蝦油腌漬而成，色澤碧綠、清脆爽口、氣味葷香，是錦州小菜的特征品種。然而，由于蝦油的鹽含量過高致使產品的風味不足，口感欠佳，這也是錦州小菜市場化的最大障礙。在自然條件下，微生物的發酵作用對腌漬蔬菜產品的風味形成、質地改善等方面都具有非常重要的作用。乳酸菌發酵在保持蔬菜原料中原有的營養成分和形成風味物質的基礎上，還賦予產品具有益生作用的生物學功效[1]。國外乳酸菌發酵蔬菜的主要代表是德國的酸白菜（Sauerkraut）、酸黃瓜（Sour cucumber）和韓國的泡菜（Kimchi），德國的酸黃瓜主要由腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides），短乳桿菌（Lactobacillus brevis），植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和戊糖片桿菌（Pediococcus pentosaceus）等多種乳酸菌共同發酵而成。韓國的泡菜中腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）是發酵過程中的優勢乳酸菌菌群，對產品的品質起到了主要作用，此外還發現了新的乳酸菌類群[2]。目前從產品中獲取優良的乳酸菌株，進行基因序列以及生物學特性研究[3-6]。國內應用乳酸菌改善發酵蔬菜的品質，武晉海等[7]以腌漬液作為發酵劑，結合植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）進行預發酵，獲得了2.24%NaCl的低鹽腌漬小黃瓜，使產品品質獲得了良好的提升。李春等[8]應用純菌接種恒溫發酵黃瓜研究表明了人工接種乳酸菌可以改善產品品質。本文從錦州蝦油腌漬小黃瓜中分離獲得的6株耐鹽乳酸菌，對其抗氧化和產生風味物質生物性能進行研究，旨在通過選育優良性能的乳酸菌作為發酵劑對錦州蝦油小黃瓜進行品質改良，達到提高產品風味、降低產品鹽度和增加產品功能的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種

菌株L3、L4、L5、L7、L15、L16，自錦州蝦油小黃瓜中分離，經形態學和生理生化初步鑒定，結果表明菌株L3、L4屬于腸球菌屬（Enterococcussp.），菌株L5、L7、L15、L16均屬于乳桿菌屬（Lactobacillussp.）[9]。

1.1.2 培養基與試劑

MRS培養基：葡萄糖10.0g，牛肉膏10.0g，蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，無水乙酸鈉4.8g，檸檬酸二銨2.0g，K2HPO42.0g，MgSO40.58g，MnSO40.25g，蒸餾水1.0L，pH6.2～6.4，121℃高壓滅菌15min。

1.1.3 儀器與設備

LDZX-40S型立式自控電熱壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；BCM-1000A型生物潔凈工作臺，蘇州市華宇凈化設備有限公司；SHP-250型生化培養箱，上海精宏試驗儀器有限公司；UV-4802紫外可見分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司；DELTA 320 pH計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.1.4 數據處理

實驗均平行測定3次，應用Excel2003對數據進行處理，用Origin8.0進行作圖。

1.2 方法

1.2.1 菌體和胞外分泌物的制備

將供試菌于MRS培養基37℃培養24h后，發酵液以4000r/min離心20min，收集菌體，并用蒸餾水洗滌3次，最后將乳酸菌細胞數調至106cell/mL，即為菌體。

供試菌于MRS培養基37℃培養24h后，收集發酵液，用蒸餾水將乳酸菌細胞數調至1010cfu/mL，在4000r/min轉速下離心20min，收集上清液，即為胞外分泌物。

1.2.2 耐鹽乳酸菌抗氧化性能測定

清除羥自由基試驗：參考文獻[10]中的方法，按公式（1）計算羥自由基清除率。

式中：A為不含樣品液含H2O2的吸光度值；A0為不含樣品液和H2O2時溶液的吸光值；Ai為含樣品液和H2O2的吸光度值。

清除DPPH自由基試驗：按文獻[11]方法略作修改。取1mL樣品液，加入0.2mmol/L的DPPH無水乙醇溶液2mL，在517nm下測定吸光度值，按公式（2）計算DPPH自由基清除率。

式中：Ai為DPPH和樣品的吸光度值；Aj為乙醇和樣品的吸光度值；A0為DPPH和乙醇的吸光度值。

還原能力測定：按文獻[12]進行。

清除超氧陰離子自由基試驗：在4.5mL的25℃水浴20min Tris-HCl緩沖液（PBS：0.05mol/L，pH8.2）中，加入4.4mL菌株樣品液和0.1mL鄰苯三酚溶液（25.0mmol/L），25℃水浴5min。然后加入1.0mLHCl（8.0mol/L），用10.0mmol/L HCl作空白，在325nm處測吸光度值。分別測定乳酸菌菌體、胞外分泌物，按公式（3）計算超氧陰離子自由基的清除率。

式中Ai為樣品液的吸光度值；A0為生理鹽水（空白）的吸光度值。

1.2.3 耐鹽性乳酸菌風味物質測定

乙醛含量測定：按文獻[13]中方法進行，將活化后的乳酸菌培養液在4℃下以4000r/min離心20min，收集上清為樣品液，按公式（4）進行計算乙醛含量。

式中：V1為碘標準溶液用量；V2為空白試驗碘標準溶液用量；M為碘標準溶液摩爾濃度。

雙乙酰含量測定：按文獻[14]的操作方法進行，按公式（5）計算雙乙酰含量。

式中：E為吸光度值；2.4為吸光度值和雙乙酰含量的換算關系；0.01為校正值。

2 結果與討論

2.1 耐鹽乳酸菌的抗氧化性能

2.1.1 乳酸菌的清除羥自由基性能

6株耐鹽乳酸菌清除羥自由基的作用如圖1所示，可以看出菌體對羥自由基的平均清除率為胞外分泌物的22倍，因此，對羥自由基的清除作用主要來自于具體本身。其中，菌株L7的清除作用最強，清除率達38.56%；其次是菌株L3，清除率超過30%，最差的為菌株L17。乳酸菌的抗氧化性能在菌體、菌體破碎物、發酵產物在自由基或過氧反應體系中，均表現出不同程度的抗氧化性能[15-17]。從錦州腌漬小黃瓜中耐鹽乳酸菌的清除羥自由基能力主要表現在菌體，而不在其產物或發酵液中，說明是菌體內的氧化酶體系可能發揮主體作用。當菌體被破碎及產物中該酶體系被破壞，清除能力損失殆盡。

圖1 6株耐鹽乳酸菌對羥自由基的清除作用Fig.1 Scavenging effects of six salt-tolerance LAB strains on hydroxyl radical

2.1.2乳酸菌的清除DPPH自由基性能

表1 6株乳酸菌對DPPH自由基的清除作用Table 1 Scavenging effects of six LAB strains on DPPH radical

6株耐鹽乳酸菌清除DPPH自由基的作用由表1所示，從表1中可以看出乳酸菌胞外分泌物的清除作用明顯強于菌體，其中菌株L16的胞外分泌物對DPPH自由基的作用最強，清除率達40%；其次是菌株L7，清除率為33.65%；其余菌株在14.3%到31.2%之間。這主要是因為菌體能產生有一些抗氧化酶和一些抗氧化物質，從而使得胞外分泌物的還原能力比菌體強[18]。

2.1.3 乳酸菌的還原性能

圖2 6株耐鹽乳酸菌的還原能力Fig.2 Results of reducing ability of six salt-tolerance LAB strains

由圖2可知，6株乳酸菌菌體以及胞外分泌物均有較強還原能力，且它們的胞外分泌物的還原能力均較菌體的還原能力強。菌株胞外分泌物的還原能力試驗所得吸光度值在0.449～1.591之間，還原能力最強的為菌株L3，其吸光度值為1.591；其次為菌株L7，吸光度值為0.875，最差的為菌株L15。

2.1.4 乳酸菌的清除超氧陰離子自由基性能

由圖3可知，胞外分泌液和菌體對超氧陰離子都具有清除作用。與菌體比較而言，胞外分泌具有更強的清除作用。菌株中L7的作用最佳，清除率達36.63%，其他菌株的胞外分泌液清除率在10%～30%之間。

2.2 乳酸菌形成風味物質性能

乳酸菌形成乙醛和雙乙酰兩種風味物質的結果如表2所示，6株乳酸菌產生的乙醛含量較高，其中菌株L16產生的含量最高超過了5.5μg/mL；其次是菌株L7，產生的乙醛含量為5.02μg/mL；菌株L3、L4、L5、L15產生的乙醛含量相近，均在2.5～3.5μg/mL之間。而產生的雙乙酰含量相對較低，產生最多的是菌株L7，含量為3.65μg/mL；其次是菌株L15；菌株L16的含量最少，幾乎不產生。乙醛和雙乙酰都是由乳酸菌在發酵過程中產生的醇、醛、酮等多種風味物質和乳酸菌在糖酵解過程中產生的乳酸、乙酸、丙酸等有機酸相互作用形成的，具有獨特風味的物質[19]。

圖3 6株乳酸菌對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.3 Scavenging effects of six salt-tolerance LAB strains on superoxide anion free radical

表2 6株乳酸菌乙醛和雙乙酰測定結果Table 2 Determination results of acetaldehyde and diacetyl of six LAB strains

3 結論

從實驗結果中可以看出，菌株L7對羥自由基的清除率為38.56%，DPPH自由基清除率為33.65%，還原能力較強，超氧陰離子清除率為36.65%；其中，除羥自由基的清除作用來自于菌體自身的抗氧化性能外，其余抗氧化能力均來自于乳酸菌胞外分泌物。與此同時，菌株L7還能產生含量較高的風味物質：乙醛和雙乙酰的含量分別為5.02μg/mL和3.65μg/mL。因此，綜合耐鹽性乳酸菌菌株清除各種自由基和產生風味物質的性能，從中篩選出菌株L7作為改進錦州腌漬小黃瓜品質的試驗菌株。

耐鹽性乳酸菌是腌制蔬菜制品中的優勢菌群，對產品的質量有著致關重要的影響。本實驗從錦州傳統風味食品蝦油小黃瓜發酵液分離篩選出的6株具有較好耐鹽性的乳酸菌中，得到生物性能較強的L7菌株。通過對耐鹽性乳酸菌的性能研究篩選出優良菌株L7，旨在提高乳酸菌發酵性能，為提升錦州腌漬小菜產品質量、改善其風味以及降低含鹽量提供理論基礎。

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