乳酸菌發酵蟹殼脫鈣的菌株篩選及條件優化

張建平，曹海龍*，趙 勇，李曙光，岳 敏，劉 航，尹 恒，杜昱光

（1.中國科學院 大連化學物理研究所，遼寧 大連 116023；2.中國科學院大學，北京100049）

幾丁質俗稱甲殼素，又名殼多糖、聚乙酰氨基葡萄糖、甲殼質等，是由N-乙酰-2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖以β-1，4-糖苷鍵連接的一種天然高分子多糖，廣泛存在于蝦、蟹、昆蟲等甲殼動物的外殼、軟體動物的器官、以及細菌、真菌和植物的細胞壁中。在自然界中，幾丁質作為一種天然高分子多糖，其蘊藏量及年產量僅次于纖維素。由于幾丁質及其衍生物在農業、醫藥、食品、環保、輕紡和日化等領域均有廣泛的應用，因此催生出了一個開發利用幾丁質及其相關產品的巨大產業[1-3]。

目前，國內外主要以蝦蟹殼為原料，采用強酸強堿來分別脫除蝦蟹殼中的碳酸鈣和蛋白的傳統方法生產幾丁質。此過程由于消耗大量的酸堿，往往會導致嚴重的環境污染問題，嚴重制約了幾丁質產業的發展，因此開發出綠色清潔的幾丁質生產工藝對幾丁質產業的健康發展至關重要[4]。

研究表明，采用生物發酵法生產乳酸來脫除蝦蟹殼中的碳酸鈣是一種行之有效的替代方法，是目前幾丁質綠色清潔生產工藝研究的熱點。由于乳酸菌發酵過程中會產生大量的乳酸[5]與蝦蟹殼中的碳酸鈣反應產生可溶的乳酸鈣，且還可通過菌體產生蛋白酶脫除蝦蟹殼中的蛋白，使得這種方法不但對環境造成的污染小，而且還能在幾丁質的生產過程中回收大量的有機鈣、蛋白和一定的色素[6]。目前，在國內外研究報道中，利用生物發酵法進行蝦蟹殼脫鈣研究所采用的微生物菌株主要為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）等[4，7-8]，且大多數研究以蝦殼原料為主，僅有少數研究采用蟹殼為原料。

基于乳酸菌具有較好的生物發酵脫鈣能力，本文對15株乳酸菌菌株進行了發酵蟹殼脫鈣的初步考察，并對篩選出的具有較高發酵蟹殼脫鈣能力的菌株進行了接種量、糖濃度和發酵時間等單因素的實驗，以期為該菌株發酵蟹殼脫鈣的進一步研究和工業化應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

見表1，其中菌株6032來自中國工業微生物菌種保藏管理中心（CICC），其余來自中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC）。

表1 乳酸菌菌株信息Table 1 The information of lactic acid bacteria

1.1.2 原料

蟹殼，由大連中科格萊克生物科技有限公司提供。

1.1.3 培養基

MRS培養基：牛肉膏10.0g，蛋白胨10.0g，酵母浸粉5.0g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸銨2.0g，磷酸氫二鉀2.0g，硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g，葡萄糖20.0g，吐溫-80 1mL，用去離子水定容至1L，調pH為6.5；固體培養基需添加2%的瓊脂粉。

發酵培養基：蛋白胨10.0g，酵母浸粉5.0g，磷酸氫二鉀2.0g，硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g，葡萄糖0～125g，蟹殼50g～300g，用去離子水定容至1L。

1.1.4 主要儀器

箱式電阻爐購自山東省龍口市先科儀器有限公司，QHZ-98A全溫振蕩培養箱購自太倉市華美生化儀器廠，DHG-9140A型電熱鼓風干燥箱購自上海一恒科學儀器有限公司，實驗室pH計購自梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司，電子天平購自梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化與種子培養

將保存于-80℃的乳酸菌劃線于新配制的MRS固體培養基進行活化，培養溫度為30℃，時間為2d。之后再將菌體劃線轉接于新固體培養基30℃培養2d。取活化好的菌株，接種1環至30mL MRS液體培養基（100mL錐形瓶），于30℃振蕩培養箱中150r/min培養20h作為種子備用。

1.2.2 原料預處理

蟹殼經粉碎后過40目篩，取大于40目部分（0.6mm～4mm）于105℃干燥5h備用。

1.2.3 菌株的篩選

將15株乳酸菌種子液分別接種至發酵培養基（100mL·250mL-1錐形瓶）中，接種量為10%（種子培養基OD600值達到4～5），于30℃振蕩培養箱150r/min培養7d。發酵結束后，將蟹殼過60目篩洗凈，于105℃干燥箱中恒溫干燥至恒重，稱重并測其灰分含量，篩選出脫鈣率最高的菌株。

1.2.4 脫鈣率的測定方法

采用測灰分的方法[9]測定脫鈣率。將發酵后的蟹殼過60目篩洗凈，于105℃干燥箱中恒溫干燥至恒重，測其質量記為M1（g）。之后于箱式電阻爐中550℃灼燒3h，測其灰分含量，記為S1（%）。發酵處理前蟹殼質量M0（g），采用同樣的方法進行處理，測灰分含量為S0（%）。脫鈣率計算公式如下所示：

1.2.5 發酵條件優化

采用單因素試驗，固定接種量為10%（種子培養基OD600值達4～5），分別考察發酵時間、葡萄糖濃度和固液比對脫鈣率的影響，從而確定最優的發酵條件。發酵時間分別取1d、3d、5d和7d。葡萄糖濃度分別采用0g/100mL、2.5g/100mL、5g/100mL、10g/100mL和12.5g/100mL，除葡萄糖之外的條件同發酵培養基。選取固液比分別為5g/100mL、10g/100mL、20g/100mL和30g/100mL進行考察，即在發酵培養基基礎上只改變蟹殼的添加量。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌發酵蟹殼脫鈣菌株的篩選

采用上述方法中菌株的篩選步驟，對15株乳酸菌進行了考察。所選15株乳酸菌均是根據以往報道常用的產乳酸的菌株，根據脫鈣率的大小篩選出脫鈣效果最好的菌株，結果如表2所示。

從表2中可以看出，所考察的15株乳酸菌中菌株AS 1.2437對蟹殼脫鈣效果最好，發酵7d蟹殼脫鈣率達到89.17%。因此，選用AS1.2437菌株進行后續研究。

2.2 發酵條件優化

表2 乳酸菌發酵蟹殼的脫鈣率比較Table 2 Decalcification ratio of crab shell after fermentation with different lactic acid bacteria

乳酸菌發酵蟹殼脫鈣的主要影響因素是發酵時間、糖濃度、接種量及發酵過程中的pH值，所以對AS 1.2437菌株進行了發酵時間、葡萄糖濃度和接種量這三個因素的考察，指標中除了測定發酵后的脫鈣率，還對發酵過程中的pH值進行了分析。

2.2.1 發酵時間對乳酸菌AS1.2437處理蟹殼脫鈣效果的影響

圖1 發酵時間對蟹殼脫鈣率及發酵液pH值的影響Fig.1 The effect of different fermentation time on pH and the decalcification ratio of crab shell

由圖1，在發酵前3d，乳酸菌AS 1.2437隨著發酵時間的延長，對蟹殼脫鈣率顯著提高，在發酵第3d，乳酸菌AS 1.2437對蟹殼脫鈣率達到81%；發酵時間延長至第5d，乳酸菌AS 1.2437對蟹殼脫鈣率相對發酵到第3d的脫鈣率提高7.81%，此后隨著發酵時間的延長乳酸菌AS 1.2437對蟹殼脫鈣效果無顯著性變化。通過對發酵過程中的pH進行監控，發現發酵前3d發酵液pH值顯著降低；發酵第3d至第5d，發酵液pH值變化趨緩；發酵第5d后，發酵液pH值無顯著變化。以上結果表明，蟹殼中碳酸鈣的脫除主要受乳酸菌AS 1.2437在發酵過程中產生的酸性物質（如乳酸）的影響較大，而發酵時間對乳酸菌AS 1.2437在代謝過程中產生酸量多少有關。綜合考慮到發酵成本、設備利用率與脫鈣率等因素，后續研究中將發酵時間設定在5d。

2.2.2 發酵液中葡萄糖濃度對乳酸菌AS 1.2437處理蟹殼脫鈣效果的影響

圖2 糖濃度對蟹殼脫鈣率及發酵液pH值的影響Fig.2 The effect of different glucose concentration on pH and the decalcification ratio of crab shell

菌體需要一定的碳源來生長繁殖，因此碳源濃度對于乳酸菌的生長及有機酸的產量有明顯的影響。當葡萄糖作為乳酸菌生長的主要碳源時，乳酸菌通過同型乳酸發酵途徑將葡萄糖轉化為乳酸。葡萄糖濃度不足將導致乳酸菌可轉化的碳源缺乏，限制了乳酸等有機酸的產生，從而會降低乳酸菌對蟹殼的脫鈣效果；葡糖糖濃度過高，可能會對菌體生長代謝造成抑制效應，對菌體代謝產酸不利，同時會造成發酵成本的增加。由于，葡萄糖濃度對乳酸菌生長和有機酸產生密切相關。在本研究中，我們考察了發酵液中葡萄糖濃度對乳酸菌處理蟹殼脫鈣效果的影響。由圖2所示，在實驗中所考察的發酵液中葡萄糖濃度范圍，隨著發酵液中葡萄糖濃度的提高，乳酸菌對蟹殼脫鈣效果逐漸提高。當發酵液中初始葡萄糖達到10g/100mL時，乳酸菌對蟹殼脫鈣率達到89.00%。

2.2.3 發酵液中蟹殼與發酵液的比例對乳酸菌AS1.2437處理蟹殼脫鈣效果的影響

圖3 固液比對蟹殼脫鈣率及發酵液pH值的影響Fig.3 The effect of different solid-liquid ratio on pH and the decalcification ratio of crab shell

為保證發酵液能夠充分潤濕蟹殼，本實驗采用的蟹殼與發酵液的比例最高為每100mL發酵液中含30g蟹殼。如圖3所示，當發酵液中蟹殼與發酵液的比超過達到20g/100mL時，發酵液pH值呈堿性，表明乳酸菌產生的有機酸較少或被中和。當發酵液中蟹殼與發酵液的比小于10g/100mL時，發酵液pH值呈酸性。從脫鈣率曲線上可以看出，蟹殼在發酵液中所占比例越小脫鈣率越高，在固液比為5g/100mL時脫鈣率高達95.5%。

3 結論與討論

該研究以工業化應用為出發點，將15株乳酸菌為出發菌株，采用與蟹殼共發酵的方式進行了篩選，選出脫鈣效果最好的編號為AS 1.2437的菌株。該菌株在接種量10%，固液比5g/100mL，糖濃度10g/100mL，發酵溫度為30℃條件下發酵5d，脫鈣率高達95.5%。植物乳桿菌AS 1.2437是發酵蟹殼脫鈣的優良菌株。

在發酵條件優化實驗中，在發酵時間0～7d、糖濃度0～12.5g/100mL和固液比5g/100mL～30g/100mL條件下，發酵時間越長、葡萄糖濃度越高、固液比越小脫鈣效果越好。綜合考慮葡萄糖濃度與固液比兩個因素，葡萄糖質量與蟹殼質量比在2∶1時效果最好，脫鈣率為95.5%；其比值為1∶1時脫鈣率約為90%。理想條件下乳酸菌利用1mol葡萄糖產生2mol乳酸，而2mol的乳酸剛好與1mol碳酸鈣反應生成1mol乳酸鈣。在此理想條件下假設蟹殼中碳酸鈣含量為50%，計算得乳酸與碳酸鈣摩爾比為2.2∶1，與實際反應過程中二者的比例相近。因此利用乳酸菌發酵蟹殼脫鈣，需要選擇利用葡萄糖產乳酸效率高的菌株。

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