釀酒酵母的β-葡萄糖苷酶活性及氧氣對酵母產(chǎn)酶的影響

張方方，劉延琳*

（西北農(nóng)林科技大學(xué) 葡萄酒學(xué)院/陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100）

酵母是葡萄酒發(fā)酵過程中起主要作用的微生物，它能將葡萄中的糖轉(zhuǎn)化成酒精及其他代謝副產(chǎn)物，釀酒酵母是將葡萄糖轉(zhuǎn)變成酒精的主要微生物[1-3]。

β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase，EC3.2.1.21）是水解葡萄中糖苷的關(guān)鍵酶[4]，它存在于植物[5]，細(xì)菌、霉菌和酵母[6-8]中，植物和微生物中β-葡萄糖苷酶的水解能力取決于糖苷配基的結(jié)構(gòu)和酶的來源[9]。有研究表明釀酒酵母能產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶[10-13]，該酶能將葡萄中的非揮發(fā)性糖苷轉(zhuǎn)化成揮發(fā)性的香氣物質(zhì)，提高葡萄酒香氣復(fù)雜性，改善葡萄酒質(zhì)量[6，14-15]。在葡萄酒發(fā)酵過程中，氧氣不僅影響酵母的生長，同時(shí)對酵母的產(chǎn)酶也會產(chǎn)生影響[16]，因此本實(shí)驗(yàn)主要研究釀酒酵母的β-葡萄糖苷酶活性及氧氣對酵母產(chǎn)酶的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

分離自新疆和寧夏葡萄酒產(chǎn)區(qū)的7株釀酒酵母，分別是F-3-8、FS-3-10、H-1-19、HS-2-1、HS-2-31、HS-2-32和M4，1株國外引進(jìn)的釀酒酵母UCD522。

1.1.2 主要試劑

對硝基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG，4-Nitrophenyl β-D-glucopyranoside），Sigma公司；咪唑（≥98.5%），Sigma公司；檸檬酸、磷酸氫二鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉，天津博迪化工股份有限公司；還原態(tài)谷胱甘肽、Triton X-100，美國Amresco公司；甲苯、乙醇，西安三浦化學(xué)試劑有限公司；YPD液體培養(yǎng)基（葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L）。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-S22電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FRESC017型高速冷凍離心機(jī)，美國Thermo公司；UV1800紫外可見分光光度計(jì)，島津公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化與培養(yǎng)

在5mL YPD液體培養(yǎng)基中接種100μL酵母菌種，28℃，150r/min條件下培養(yǎng)24h。活化的菌株接種量為1%（v/v），接種至pH值為5 YPD液體培養(yǎng)基中，28℃，180r/min條件下培養(yǎng)24h，重復(fù)兩次。取樣測上清液，壁膜間隙，細(xì)胞內(nèi)的β-葡萄糖苷酶。

1.3.2樣品處理

上清液：取1mL酵母菌液，4℃，10000×g離心10min，取0.2mL上清液測β-葡萄糖苷酶。

壁膜間隙：取1mL菌液，在4℃條件下10000×g離心10min，1mL冷卻無菌水洗菌體2次，加入0.2mL檸檬酸-磷酸緩（pH5，0.1mol/L）沖溶液，測酵母壁膜間隙β-葡萄糖苷酶。

細(xì)胞內(nèi)：取1mL菌液，在4℃條件下10000×g離心10min，1mL冷卻無菌水洗菌體2次，加1mL 75μmol/L pH值為7.5咪唑緩沖溶液，迅速加50μL，0.3mol/L谷胱甘肽，0.01mL 10%triton x-100，50μL甲苯/乙醇（1/4 v/v），劇烈震蕩5min，4℃條件下10000×g離心10min，用1mL冷卻無菌水洗菌體兩次，加入0.2mL pH5檸檬酸-磷酸緩沖溶液，分析酵母的胞內(nèi)酶[17-19]。

細(xì)胞干重：取4mL菌液，10000×g離心10min，冷卻的無菌水洗菌體2次，105℃烘至恒重，分析天平稱重。

1.3.3 酶活測定

分別將上一步得到的0.2mL初酶液加0.2mL底物pNPG（5mmol/L溶于pH5檸檬酸-磷酸緩沖溶液），30℃水浴反應(yīng)1h，然后加pH值為10.2，0.2mol/L碳酸鈉緩沖溶液終止反應(yīng)，400nm下測吸光度值[19]。β-葡萄糖苷酶的酶活表示為每小時(shí)1mL菌液中反應(yīng)生成的對硝基苯酚的μmol數(shù)。

1.3.4 厭氧條件對酵母產(chǎn)酶的影響

將活化的酵母接種至含有80%體積的YPD（pH5）液體培養(yǎng)基的離心管中，接種量為1%（v/v），28℃條件下靜止厭氧培養(yǎng)72h，每個菌株重復(fù)兩次。分別測上清液，壁膜間隙，細(xì)胞內(nèi)的β-葡萄糖苷酶酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株的β-葡萄糖苷酶活性差異

不同種類酵母的β-葡萄糖苷酶在酵母中的分布不同[20]，本研究測定了8株釀酒酵母的上清液，壁膜間隙和細(xì)胞內(nèi)的β-葡萄糖苷酶酶活，酵母的β-葡萄糖苷酶是由這三部分酶相加所得。

本研究供試釀酒酵母菌株的β-葡萄糖苷酶活性見表1。由表1可以看出，釀酒酵母β-葡萄糖苷酶主要位于壁膜間隙和細(xì)胞內(nèi)，菌株M4的β-葡萄糖苷酶最高，為4.10μmol pNP·mL-1·h-1。上清液中，F(xiàn)-3-8、FS-3-10、M4和UCD522這一組菌株酶活最高，與其他酵母上清中的β-葡萄糖苷酶差異顯著（p＜0.05）。在細(xì)胞的壁膜間隙中，菌株M4的β-葡萄糖苷酶最高，占其總酶的43.90%。F-3-8、FS-3-10和M4這三株菌細(xì)胞內(nèi)的β-葡萄糖苷酶較高，與其他的菌株具有顯著性差異，其中M4的酶最高，占其總產(chǎn)酶的40.24%。

2.2 厭氧條件對釀酒酵母β-葡萄糖苷酶產(chǎn)酶的影響

葡萄酒釀造的過程中幾乎是一個厭氧的過程，因此研究氧氣對酵母產(chǎn)酶具有重要的意義。氧氣不僅影響酵母的生長，也影響酵母的產(chǎn)酶[20]。表2表示厭氧條件下釀酒酵母上清液，壁膜間隙和細(xì)胞內(nèi)的β-葡萄糖苷酶活性。厭氧條件下菌株M4的產(chǎn)酶最高，為0.91μmol pNP·mL-1·h-1，但僅占有氧條件下產(chǎn)酶的22.20%。上清中菌株F-3-8和FS-3-10產(chǎn)β-葡萄糖苷酶最高，分別為0.43和0.40μmolpNP·mL-1·h-1，其次是菌株M4。菌株M4壁膜間隙和胞內(nèi)酶最高，其酶活分別為厭氧條件下酶的25.27%和35.16%，厭氧條件下M4的酶主要分布在上清和細(xì)胞內(nèi)。

表1 釀酒酵母的β-葡萄糖苷酶活性Table 1 β-glucosidase activity ofS.cerevisiae

表2 厭氧條件下釀酒酵母的β-葡萄糖苷酶Table 2 β-glucosidase activity ofS.cerevisiaewith anaerobic condition

從附圖可以看出在有氧條件下酵母合成的β-糖苷酶顯著高于厭氧生長時(shí)產(chǎn)生的酶，表明氧氣可以促進(jìn)酵母β-葡萄糖苷酶的合成。

3 結(jié)論

對于8株釀酒酵母的研究表明菌株M4的產(chǎn)酶最高，相同種的菌株產(chǎn)酶不同，因此酵母的產(chǎn)酶具有菌株依賴性。β-葡萄糖苷酶主要位于酵母的細(xì)胞間隙和胞內(nèi)，但是細(xì)胞內(nèi)部的β-葡萄糖苷酶對糖苷的水解不能起作用，只有將β-葡萄糖苷酶分泌到壁膜間隙或細(xì)胞外部的環(huán)境中才能水解糖苷。

附圖 氧氣對釀酒酵母β-葡萄糖苷酶的影響Attached Fig.Effect of oxygen onS.cerevisiaeβ-glucosidase activity

葡萄酒的發(fā)酵是在厭氧條件下進(jìn)行的，氧氣不僅影響酵母的生長，而且對酵母的產(chǎn)酶也有影響，有氧條件能促進(jìn)酵母產(chǎn)酶。有氧條件下菌株M4上清液，壁膜間隙和細(xì)胞內(nèi)酶活分別是厭氧條件產(chǎn)酶的1.81，7.83和5.16倍，分別為0.65，7.83和5.16μmol pNP·mg-1·h-1。葡萄酒發(fā)酵過程中適當(dāng)通氣，有益于提高β-葡萄糖苷酶的產(chǎn)生，從而調(diào)控香氣的生成，影響葡萄酒的感官質(zhì)量。

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