多重耐藥鮑曼不動桿菌基因型檢測及其耐藥性分析

呂娜 劉仁淳 陳柳勤

鮑曼不動桿菌的分離率及耐藥性較高，是臨床多種感染的主要誘發菌種。由于近些年來抗生素的濫用問題，造成鮑曼不動桿菌的多重耐藥性，影響臨床的施治與用藥[1]。多重耐藥性細菌目前已經成為世界醫學界共同面臨的難題之一[2]，泛耐藥性細菌感染甚至可能將患者置于無藥可救的境地。因此研究多重耐藥性鮑曼不動桿菌的基因型和耐藥性具有重要意義，可有效指導臨床治療的具體用藥方法和劑量，為臨床提供參考。

1 資料與方法

1.1 菌株來源 選取東莞市長安醫院2011年1-12月間住院患者的血液、尿液、痰液、分泌物等樣本進行分離，并獲得多重耐藥鮑曼不動桿菌共20株（無重復株）作為研究對象。樣本來源：腦外科8例，神經科3例，呼吸科5例，骨科1例，皮膚科2例，普外科1例。采用銅綠假單胞菌（ATCC27853）和大腸埃希菌（ATCC25922）作為標準菌株，由廣東省臨床檢驗中心提供。

1.2 細菌鑒定 采用法國生物梅里埃公司提供的ATB微生物鑒定儀和配套的ID鑒定卡進行細菌鑒定。

1.3 儀器和試劑 MH瓊脂培養基購自江門凱林生物工程有限公司，藥敏紙片由英國Oxoid生物公司提供，PCR聚合酶鏈反應儀由美國ABI公司生產，電泳儀由創博環球（北京）生物科技有限公司提供，凝膠成像系統是英國UVI公司產品，Premix Taq酶購自大連寶生物工程有限公司，DL 2000 DNA Maker購自上海酶聯生物科技有限公司。

1.4 藥敏試驗 采用瓊脂擴散法（K-B法）進行藥敏試驗，對研究菌株耐藥性進行檢測，試驗結果評價參照CLSI2011提出的相關檢驗標準[3]。

1.5 PCR模板 選用對亞胺培南敏感性弱的鮑曼不動桿菌菌株利用煮沸法進行PCR模板的制備，菌株常規接種于血平皿上，待24h后挑選出一些菌落轉置到EP管，150μL滅菌蒸餾水加入EP管，共同煮沸10min，再迅速冷卻至4℃。所得溶液以12000轉進行分離處理，5min后取上清液建立PCR模板，保存于－20℃環境下備用。

1.6 PCR擴增 采用PCR法對OXA基因進行檢測，分別加入Premix Taq酶和上下游引物，以ddH2O補足達50μL后，于94℃行5min預變性和45s變性，再轉置52℃行45s退火，轉置72℃行延伸1min，循環處理，共35次，末次處理于72℃延伸至10min。獲得PCR產物取出5μL，以濃度1.5%的瓊脂糖凝膠電泳處理后進行分析。

1.7 DNA序列 PCR產物送達上海英駿生物技術有限公司，實施進一步的純化和雙向測序，并于網上進行同源比對分析，確定菌種基因型。

2 結果

2.1 耐藥性 20株鮑曼不動桿菌對常見的10抗菌藥物敏感率及耐藥率分布情況見表1，亞胺培南、頭孢曲松耐藥率可達98%，其余6種抗生素耐藥率均超出或等于80%，按耐藥率由高到低排序為：頭孢他啶、環丙沙星、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢吡肟、慶大霉素、復方新諾明、哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素；按敏感性由低至高排序：亞胺培南、頭孢曲松、頭孢他啶、環丙沙星、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢吡肟、哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素、慶大霉素、復方新諾明。

表1 20株鮑曼不動桿菌對10種抗生素的敏感性試驗結果比較

2.2 PCR擴增結果 20株鮑曼不動桿菌中，17株（85%）經OXA-23擴增為陽性，其與GQ849192序列號的鮑曼不動桿菌同源；14株（70%）經OXA-51擴增為陽性，與GQ525851序列號的鮑曼不動桿菌同源。

3 討論

鮑曼不動桿菌是一種非發酵革蘭陰性桿菌，廣泛存在于自然界、醫院環境及人體皮膚、粘膜、呼吸道和泌尿生殖道中，常引起住院患者呼吸道感染、菌血癥、中耳炎、泌尿系和傷口感染等。該菌對多數常用抗菌藥耐藥率高，具有多重耐藥性目前已被證實[4-5]，在臨床分離的非發酵菌中僅次于銅綠假單胞菌，是引起醫院感染的重要病原菌之一，故而了解該菌種的耐藥性及基因型對于有效指導臨床給藥和療效觀察具有重要意義。

在本組研究中，鮑曼不動桿菌對亞胺培南等大量碳青霉菌烯類抗生素的耐藥性及高，尤其對本組研究的8種用藥耐藥性均達到80%以上，這也提示了鮑曼不動桿菌同時對其它廣譜抗菌類藥物存在較高的耐藥性。耐藥性的出現與臨床濫用藥物有關，也與患者自身的機體特征有關。鮑曼不動桿菌的耐藥機制包括染色體基因突變、外膜孔蛋白改變、藥物主動外排系統和產生滅活酶等，其耐藥基因可通過接合性質粒、轉座子、整合型噬菌體、整合子的水平傳遞等發生擴散[6]。上述原因使得鮑曼不動桿菌對抗菌藥物產生交叉耐藥，出現多重耐藥菌且傳播迅速。但鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗菌藥的耐藥機制，目前尚不十分明確。根據本組對基因型的研究，本研究收集的鮑曼不動桿菌與OXA-23和51有相互作用，提示鮑曼不動桿菌的耐藥性產生可能與易產生OXA-23和51的碳青霉烯類酶有關。

總之，鮑曼不動桿菌的多重耐藥性已經成為臨床治療的棘手問題，醫生在用藥時一方面要注意了解鮑曼不動桿菌的高耐藥性藥品，以避免用藥不當，另一方面仍需更多的相關研究明確對碳青霉烯類抗菌藥耐藥機制，以便于尋找更有利于臨床抑菌殺菌治療的有效藥品。

[1]陳濤，高燕渝.泛耐藥鮑曼不動桿菌引起醫院感染情況研究[J].基層醫學論壇，2012，16（7）：2464-2465.

[2]趙穎瑩，崔金環.鮑曼不動肝菌對青霉烯類抗生素的耐藥性及其基因的分析[J].微生物學免疫學進展，2012，40（3）：26-28.

[3]鄧思健，伍曉峰，鐘海波，等.多重耐藥鮑曼不動桿菌臨床株的主動外排泵編碼基因檢測及分析[J].新醫學，2011，42（9）：608-610.

[4]王衛華，陳潔，毛雄英，等.泛耐藥鮑曼不動桿菌獲得性耐藥基因和可移動遺傳元件檢測與指標聚類分析[J].中華臨床感染病雜志，2012，5（1）：9-11.

[5]佘婷婷，沈繼錄，徐元宏，等.廣泛耐藥鮑曼不動桿菌耐碳青霉烯類抗生素膜蛋白機制研究[J].中國感染與化療雜志，2012，12（4）：280-282.

[6]李小霞.鮑曼不動桿菌的醫院感染調查和耐藥性分析[J].國際檢驗醫學雜志，2010，31（9）：1009-1010.