絲氨酸蛋白酶抑制劑在卵巢癌發(fā)展和血管生成中的作用機制研究

馬 瑛，彭芝蘭，陳 欣

(1.四川大學華西第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川 成都 610041;2.四川省綿陽市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川 綿陽 621000;3.成都地奧集團篩選中心，四川 成都 610041)

卵巢癌惡性程度高、缺乏早期診斷手段，雖對化療比較敏感，但化療藥物的毒副反應及長期治療易產(chǎn)生耐藥等因素，都導致卵巢癌的臨床治療有一定困難。腫瘤的生長和轉移是血管依賴性的，卵巢癌組織有血管豐富、生長迅速的特點，抗卵巢癌血管形成是一種新的治療策略。絲氨酸蛋白酶抑制劑(mammary serpin，MASPIN)是絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族中的新成員，大量研究發(fā)現(xiàn)它作為腫瘤抑制基因對腫瘤的生長、侵襲、轉移有明顯抑制作用，近來更被證實是一種有效的血管生成抑制因子［1］。本研究通過免疫組織化學LSAB方法檢測MASPIN、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)組織中的表達，分析其與卵巢癌病理類型、病理分級、手術病理分期等病理特點的關系;體外實驗進一步檢測卵巢癌細胞中MASPIN高表達對VEGF和表達的影響，旨在探討MASPIN在卵巢癌的發(fā)展和血管生成中的作用，為以MASPIN為分子靶點的抗腫瘤基因治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究采用的EOC組織(35例)為2004年10月至2005年4月在四川大學華西第二醫(yī)院婦科接受手術治療患者(年齡35～68歲)的新鮮卵巢組織標本，術前未行化療、放療或生物治療，術后病理診斷確診并且患者臨床病理資料完整，病理診斷均由有經(jīng)驗的病理專家復核。病理類型:漿液性腺癌22例，黏液性癌5例，子宮內(nèi)膜樣腺癌5例，透明細胞癌 3例;病理分級:高分化 3例(8.6)，中分化6例(17.1)，低分化26例(74.3);臨床分期I期14例(40.0)，Ⅱ 期2例(5.7)，Ⅲ 期l1例(31.4)，IV期8例(22.9);淋巴結轉移:有轉移8例(22.9 9/6)，無轉移27例(77.1);腹水:有腹水19例(54.3)，無腹水16例(45.7)。同期正常卵巢組織31例(子宮肌瘤21例、子宮腺肌癥10例)。卵巢組織的獲取均事先向患者說明，并取得同意。

1.2 主要試劑和儀器 兔抗人MASPIN抗體(AbS4A)購自Calbioehem公司，鼠抗人VEGF單抗購于北京中杉金橋生物技術有限公司，SP試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、高保真 pfu DNA聚合酶、λEcoT14 I digest購自 MBI;T4-DNA連接酶購自NEB;PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自申能博彩生物科技有限公司，質(zhì)粒純化試劑盒為Omega公司產(chǎn)品;PCR引物由上海博亞生物技術有限公司合成。Trizol Reagent(Invitrogen)，TaKaRa One step PCR for RNA Kits(AMV)購自天泰生物技術有限公司。轉染試劑梭華-SofastTM購自廈門太陽馬生物工程有限公司;熒光素酶底物試劑購自Promega公司(CAT.NO.E1531);細胞培養(yǎng)材料購自成都哈里公司。Forma-80℃冰箱;BECKMAN冷凍高速離心機;eppendorf臺式高速離心機;BIORAD電泳槽，電泳儀;恒溫水浴箱，恒溫空氣搖床，恒溫空氣培養(yǎng)箱，恒溫烤箱;Hybaid PCR儀;Kodak凝膠成象系統(tǒng)及圖象分析軟件。HARRISCO2孵箱，NUAIRE超凈工作臺，倒置顯微鏡，96孔細胞培養(yǎng)板，Wallace Victor2多功能發(fā)光檢測儀(PerkinElmer公司)，DU 640(BECKMAN COULTERTM)分光光度計;酶標儀 MICROPLATE READER(BIO-RAD公司)。BIORAD掃描儀。

1.3 質(zhì)粒載體、宿主菌和細胞 pCDNA3-MASPIN、大腸桿菌JM109、人體正常前列腺組織由成都地奧集團藥物篩選中心提供。SKOV3為人卵巢漿液性上皮癌細胞株，由四川大學華西第二醫(yī)院實驗中心婦科腫瘤實驗室提供。

1.4 免疫組織化學檢測MASPIN、VEGF在卵巢癌組織中的表達 將切除的新鮮標本經(jīng)40 g/L甲醛固定，石蠟包埋，切片厚度4 Fm。免疫組織化學染色步驟按試劑盒說明進行。用PBS代替一抗作為陰性對照，公司提供的陽性切片為陽性對照。MASPIN抗體(1∶400)、VEGF抗體(1∶200)稀釋。MASPIN、VEGF陽性為胞漿棕色顆粒沉著，用Olympus DP70采圖系統(tǒng)捕獲圖像，采用Laserpix圖像分析軟件進行分析，測定IOD。

1.5 MASPIN穩(wěn)定表達細胞株的構建 ①SKOV3細胞培養(yǎng)、傳代和保種:人卵巢癌細胞株SKOV3細胞培養(yǎng)、傳代、保種參照司徒振強的《細胞培養(yǎng)》［2］。②細胞轉染及轉染克隆的篩選:用陽離子聚合物法介導DNA轉移，轉染后將細胞置于37℃，5%CO2孵育箱孵育。設未轉染細胞作對照，用梯度濃度的G418篩選培養(yǎng)液進行篩選，G418的最適濃度為700 μg/ml。每3天換一次液，2周后挑取抗G418克隆擴增，分別命名為 SKOV3-MASPIN和 SKOV3-vector，并進行 RT-PCR和Western blot、ABC免疫酶染色法鑒定。③細胞總RNA的提取:用Trizol Reagent提取SKOV3細胞總RNA，樣本為轉染了pcDNA3-MASPIN、pcDNA3空載體質(zhì)粒的SKOV3細胞和未轉染的SKOV3細胞，方法參照試劑說明書進行。取少量RNA以電泳鑒定完整性，以紫外分光光度法檢測濃度和純度。調(diào)整濃度存放于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 半定量逆轉錄聚合酶鏈反應RT-PCR分析用于半定量RT-PCR分析的引物序列Primer Premier 5.0設計軟件設計，同時設計內(nèi)對照基因GAPDH引物，擴增片段大小約485 bp。RT-PCR分析采用TAKARA公司的ONE STEP RT-PCR試劑盒，依據(jù)說明進行。

1.7 ABC免疫酶染色法檢測 MASPIN、VEGF、HPA蛋白的表達 SKOV3及G418篩選陽性的細胞，用0.25%胰酶消化，制成單細胞懸液，以1×106密度將細胞分別接種于預先放置蓋玻片的6孔培養(yǎng)板，置孵箱培養(yǎng)2天，取出蓋玻片，浸入磷酸鹽緩沖液PBS洗2次，加4%PFA(多聚甲醛)固定30分鐘，用PBS洗5分鐘×3次。0.3%H2O2-甲醇10秒，PBS洗5分鐘×3次。0.1%triton×100室溫下5分鐘，PBS洗5分鐘×3次。5%BSA(牛血清白蛋白)封閉，室溫下10分鐘，不洗，棄多余液體。染色步驟按試劑盒說明進行。每批實驗中均設立陽性和陰性對照，試劑公司提供的陽性切片作陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。MASPIN抗體(1∶100)、VEGF抗體(1∶200)。用Olympus DP70采圖系統(tǒng)捕獲圖像，每組細胞取4個視野，采用Laserpix圖像分析軟件進行分析，測定IOD。

1.8 統(tǒng)計學方法 所有計算均用SPSS 13.0軟件進行，由統(tǒng)計學專業(yè)人員進行統(tǒng)計學分析。分類資料率的比較采用卡方檢驗，MASPIN、VEGF與臨床各病理指標的比較采用兩組獨立樣本的t檢驗。VEGF、MASPIN之間的相關性比較采用直線或秩相關分析。三組及以上資料的比較，首先進行方差齊性檢驗，方差齊者用多組計量資料的方差分析進行比較，如有意義則采用q檢驗兩兩比較。采用Kodak軟件對RT-PCR條帶進行光密度值分析，分別以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)和肌動蛋白(β-actin)作系統(tǒng)內(nèi)參。通過計算對目的基因的表達進行半定量。目的基因的表達指數(shù)=目的基因條帶的光密度值/相應內(nèi)參照條帶的光密度值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MASPIN、VEGF在EOC的表達以及EOC臨床病理特點

2.1.1 MASPIN、VEGF在EOC中的表達 MASPIN蛋白主要為細胞漿表達(圖1)，在正常卵巢生發(fā)上皮細胞和EOC細胞的陽性表達分別為16.1%(5/31)和57.1%(20/35)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=10.07，P＜0.01)。VEGF蛋白的陽性表達定位于細胞漿，周圍的血管內(nèi)皮細胞也有陽性表達(圖2)，其白在正常卵巢生發(fā)上皮細胞和EOC細胞的陽性表達分別為25.8%(8/31)和77.1%(27/35)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=15.39，P ＜ 0.01)。

圖1 MASPIN在卵巢癌中的陽性表達(IHC)200×

圖2 VEGF在卵巢癌中的陽性表達(IHC)200×

2.1.2 MASPIN、VEGF表達與EOC臨床病理特點見表1。其中MASPIN蛋白在非漿液性卵巢癌中表達高于漿液性卵巢癌中的表達，MASPIN蛋白表達還隨著手術－病理分期的進展而下調(diào)，在I+II期和III+IV期中IOD值差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);在無腹水組中MASPIN蛋白表達高于有腹水組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);淋巴結轉移各組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。在有腹水組和無腹水組IOD值分別為2.8466±1.4283和1.5526±1.3275，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。在其余各組間VEGF蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表1 M ASPIN、V EG F表達與臨床病理指標

2.1.3 MASPIN與VEGF的相關性 分析發(fā)現(xiàn)MASPIN與VEGF呈負相關(r=－0.738，P＜0.05)，即MASPIN的表達水平越高，VEGF的表達則相應的降低。

2.2 轉染克隆的鑒定

2.2.1 AB免疫酶染色 SKOV3、SKOV3-pcDNA3、SKOV3-MASPIN組的IOD值分別為493.5075±394.3448、415.5225 ± 144.8998、3629.547 ±1602.8288。SKOV3、SKOV3-pcDNA3 細 胞 中MASPIN表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，而轉染MASPIN－cDNA的SKOV3-MASPIN細胞中MASPIN表達較轉染前及空載體組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，即轉染 MASPIN－cDNA的 SKOV3-MASPIN中MASPIN表達增強(圖3～圖5)。

2.2.2 RT-PCR SKOV3、SKOV3-pcDNA3、SKOV3-MASPIN細胞采用RT-PCR方法，用Kodak凝膠成象系統(tǒng)及圖象分析軟件存儲圖象并分析結果，以MASPIN與GAPDH基因擴增產(chǎn)物電泳帶的光密度比值，反映MASPIN的表達水平(圖6)。結果顯示，SKOV3、SKOV3-pcDNA3、SKOV3-MASPIN 組的光密度比值分別為 0.6720±0.0131，0.6674±0.0128，1.0560±0.0052。SKOV3-MASPIN組 MASPIN表達水平明顯升高(P＜0.05)。而SKOV3、SKOV3-pcDNA3組MASPIN表達變化差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

圖3 SKOV3細胞中的MASPIN表達(IC)400× 圖4 SKOV3-vector細胞中的MASPIN表達(IC)400× 圖5 SKOV3-MASPIN細胞中的MASPIN表達(IC)400× 圖6 篩選克隆的PCR擴增鑒定

2.2.3 Western Blot SKOV3、SKOV3-pcDNA3、SKOV3-MASPIN細胞采用 Western Blotting方法，用BIORAD掃描儀捕獲圖像，Kodak圖象分析軟件分析結果，以MASPIN與β-actin帶的光密度比值，反映MASPIN的表達水平(圖7)。結果顯示，SKOV3、SKOV3-pcDNA3、SKOV3-MASPIN組的光密度比值分別為 0.7823±0.0108，0.7653±0.0186，1.6549±0.1074。SKOV3-MASPIN組MASPIN表達水平明顯升高 (P ＜0.05)。SKOV3、SKOV3-pcDNA3組MASPIN表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

2.3 MASPIN過表達對VEGF表達的影響

2.3.1 MASPIN過表達對VEGF的mRNA表達的影響 SKOV3、SKOV3-pcDNA3、SKOV3-MASPIN 細胞采用RT-PCR方法，用Kodak凝膠成象系統(tǒng)及圖象分析軟件存儲圖象并分析結果，以VEGF與GAPDH基因擴增產(chǎn)物電泳帶的光密度比值，反映MASPIN的表達水平(圖8)。結果顯示，SKOV3、SKOV3-pcDNA3、SKOV3-MASPIN組的光密度比值分別為 1.015±0.018、0.991±0.010和 0.901±0.010。SKOV3-MASPIN組VEGF表達水平明顯降低(P＜0.05)。SKOV3、SKOV3-pcDNA3組 VEGF表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

圖7 pcDNA3-MASPIN在SKOV3細胞中穩(wěn)定轉染的Western Blot結果 1.SKOV3總蛋白;2.SKOV3/pcDNA3總蛋白;3.SKOV3/pcDNA3-MASPIN總蛋白 圖8 PCR結果 1:SKOV3;2:SKOV3/pcDNA3;3:SKOV3/pcDNA3-MASPIN

2.3.2 MASPIN過表達對VEGF蛋白表達的影響采用ABC免疫酶染色法檢測轉染MASPIN前后VEGF蛋白表達的變化。SKOV3、SKOV3-pcDNA3和SKOV3-MASPIN組的IOD值分別2350.257±1386.7257、2440.083±1006.6204 和 331.0025±212.0308。SKOV3、SKOV3-pcDNA3細胞中 VEGF表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，而轉染MASPIN－cDNA的SKOV3-MASPIN細胞中VEGF表達較轉染前及空載體組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，轉染 MASPIN－cDNA的 SKOV3-MASPIN細胞中VEGF表達下降(圖9～11)。

圖9 SKOV3細胞中的VEGF表達(IC)400×

圖1 0 SKOV3－vector細胞中的VEGF表達(IC)400×

圖1 1 SKOV3－MASPIN細胞中的VEGF表達(IC)400×

3 討論

MASPIN是一種新的絲氨酸蛋白酶抑制劑基因，MASPIN的表達隨著腫瘤的發(fā)展而逐漸消失，恢復腫瘤細胞中MASPIN的表達，能夠抑制腫瘤細胞的生長、運動、轉移能力，因此將其定位為腫瘤抑制基因［3］。隨著對MASPIN內(nèi)在分子機制的深入研究發(fā)現(xiàn)在不同類型的細胞中，MASPIN表達形式不同，發(fā)揮的作用也不相同，MASPIN的表達與功能也尚無定論。Boltze等［4］對結腸癌的研究發(fā)現(xiàn)，MASPIN在88%～100%的腺瘤和正常組織以及69%的腫瘤中表達陽性，且MASPIN的弱表達或陰性表達與腫瘤復發(fā)呈正比。與之相反，Song等［5］研究發(fā)現(xiàn)Maspin在由正常胃組織向胃癌的進展中表達水平逐漸升高，且與腫瘤分期、淋巴結轉移相關，認為Maspin在胃癌進展、脈管形成及轉移中扮演著重要角色。

為探討MASPIN在卵巢癌發(fā)展中的作用，本研究采用LSAB法檢測了MASPIN蛋白在31例正常卵巢組織和35例卵巢癌組織中的表達，發(fā)現(xiàn)MASPIN蛋白主要定位于細胞漿，在正常卵巢組織中為陰性或弱陽性表達，陽性率為16.1%(5/31)，與卵巢癌組織中的57.1%(20/35)相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。手術病理分期是對卵巢癌治療和預后影響最大的指標［6］，本研究結果顯示，MASPIN蛋白表達在早期EOC(I、II)高于晚期(III、IV)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，說明MASPIN的表達隨著卵巢腫瘤的進展而下調(diào)。從病理類型分析，MASPIN蛋白在非漿液性卵巢癌中表達高于在漿液性卵巢癌中表達，即MASPIN主要在非漿液性癌中表達，而漿液性癌的5年存活率低于黏液性和子宮內(nèi)膜樣癌［7］。據(jù)報道有腹水與無腹水組患者相比，前者的 5年生存率僅為 5%，而后者達45%［8］。這也說明MASPIN能在一定程度上抑制卵巢癌的轉移。

本研究結果顯示，MASPIN在卵巢癌中表達上調(diào)，但其與低手術-病理分期、非漿液性腫瘤、無腹水形成的相關性是與它的腫瘤抑制基因特性相符合的。

對于MASPIN在不同類型細胞中的表達水平不同、發(fā)揮作用不相同的這些矛盾結果可能有以下幾種解釋:①與maspin蛋白發(fā)生相互作用的相關蛋白在不同類型細胞中有特定的表達，因而maspin蛋白在不同類型細胞中的功能不同［9］;②maspin在不同細胞中的亞定位也對其功能起著關鍵的影響［10］;③maspin在腫瘤細胞中復雜的后生性改變，如maspin在不同細胞類型中特異表達，受到其啟動子區(qū)域甲基化的控制［11］。

Zhang等［1］在對乳腺癌、前列腺癌的研究中，通過體內(nèi)體外實驗發(fā)現(xiàn)MASPIN的腫瘤抑制活性可能主要依賴其對新生血管生成的抑制能力。因此MASPIN被看作一種新的腫瘤血管抑制因子。卵巢癌是一種實體腫瘤，在腫瘤間質(zhì)中存在著高密度的微血管，卵巢癌的生長轉移與微血管的形成密切相關。抗血管生成基因治療在卵巢腫瘤的動物實驗中已取得了顯著療效，在卵巢癌的治療中具有很大潛力［12］。

已有的研究結果已證實VEGF與卵巢惡性腫瘤的增殖、浸潤和轉移密切相關［13］。本研究中VEGF在卵巢癌細胞中的表達(77.1%)與正常卵巢組織細胞(25.8%)相比增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，還發(fā)現(xiàn)VEGF與腹水形成有一定相關性，進一步分析MASPIN與VEGF之間的相關性，結果顯示MASPIN表達與VEGF有顯著負相關性(P＜0.05)，因此推測在卵巢癌中，MASPIN具有抑制血管生成作用，并且可能與VEGF相關。

為進一步探討MASPIN抑制卵巢癌血管生成的可能分子機制，本研究將真核表達質(zhì)粒pcDNA3-MASPIN-cDNA轉染卵巢癌細胞SKOV3，應用RTPCR和免疫細胞化學方法分別從基因轉錄和蛋白表達水平來了解過表達MASPIN對VEGF的影響，結果發(fā)現(xiàn)無論是基因轉錄還是蛋白表達水平，MASPIN對VEGF表達都有明顯抑制作用(P＜0.05)，進一步說明MASPIN對腫瘤血管的抑制作用可能與VEGF有關。但MASPIN調(diào)節(jié)VEGF的內(nèi)在機制目前尚無研究。有報道指出，Bcl-2基因可能對 VEGF 的表達有一定調(diào)控作用［14，15］而 MASPIN可以通過包括線粒體和Bcl-2蛋白家族在內(nèi)的信號轉導途徑增強內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞的凋亡［16～18］。因此推測MASPIN對VEGF的調(diào)節(jié)可能是通過抑制Bcl-2基因的表達、增強內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞的凋亡的途徑來發(fā)揮作用的。

綜上所述，與正常卵巢組織相比，MASPIN基因在卵巢癌中表達上調(diào)，但MASPIN在卵巢癌的發(fā)展過程中可能仍發(fā)揮著腫瘤抑制基因的作用。MASPIN能從蛋白質(zhì)和mRNA水平下調(diào)卵巢癌中VEGF的表達，并可能通過這一機制抑制卵巢癌血管生成。MASPIN表達對卵巢腫瘤進展和血管生成的抑制作用，為以MASPIN為基礎的抗腫瘤血管生成基因治療提供了有利的理論依據(jù)。

［1］Zhang M，Volpert O，Shi YH，etal.Maspin is an angiogenesis inhibitor［J］.Nat Med，2000，6(2):196-199.

［2］司徒振強，吳軍正.細胞培養(yǎng)［M］.西安:世界圖書出版社西安分公司，2004:78-88.

［3］Zou Z，Anisowicz A，Hendrix MJC，et al.Maspin，a serpin with tumor-suppressing activity in human mammary epithelial cells［J］.Science，1994，263(5146):526-529.

［4］Boltze C.Loss ofmaspin is a helpful prognosticator in colorectalcancer.a tissue microarray analysis［J］.Pathol Res Pract，2005，200(11-12):783-790.

［5］Song SY，Son HJ，Kim MH，et a1.Prognostic significance ofmaspin expression in human gastric edenocarcinoma［J］.Hepatogsstroenterology，2007，54(75):973-976.

［6］Einhorn N，Nilsson B，Sjovall K.Factors influencing suivival in carcinoma of the ovary:Study from awell defined Ewidish population［J］.Cancer，1985，55(9):2019-2015.

［7］TropéC.Prognostic factors in ovarian cancer.Cancer Treat Res.1998，95:287-352.

［8］Puls LE，Duniho T，Hunter JE，et al.The prognostic implication of asitis in advanced ovarian cancer［J］.Gynocol Oncol，1996，61(1):109.

［9］Heighway J，Knapp T，Boyce L，et al.Expression profiling of primary non-small cell lung cancer for target identification［J］.Oncogene，2002，21(50):7749-7763.

［10］Reis-Filho JS，Milanezi F，Schmitt FC.Maspin is expressed in the nuclei of breastmyoepithelial cells［J］.JPathol，2002，197(2):272-273.

［11］Futscher BW，Oshiro MM，Wozniak RJ，etal.Role for DNAmethylation in the control of cell type specific maspin expression［J］.Nat Genet，2002，31(2)，175-179.

［12］Kohno T，MizukamiH，SuzukiM，etal.Interleukin-10mediated inhibition of angiogenesis and tumor growth in mice bearing VEGF2 producing ovarian cancer［J］.Cancer Res，2003，63(16):5091-5094.

［13］van der Bilt AR，van der Zee AG，de Vries EG，etal.Multiple VEGF family members are simultaneously expressed in ovarian cancer:a proposed model for bevacizumab resistance［J］.Curr Pharm Des，2012，18(25):3784-3792.

［14］Fernandez A，Udagawa T，Schwesinger C et al.Angiogenic Potential of Prostate Carcinoma CellsOverexpressing bcl-2［J］.JNation Cancer Institute，2001，93(3):208-213.

［15］Trisciuoglio D，Gabellini C，Desideri M，et al.Involvement of BH4 domain of bcl-2 in the regulation of HIF-1-mediated VEGF expression in hypoxic tumor cells［J］.Cell Death Differ，2011，18(6):1024-1035.

［16］Zhiqiang Z，Heidi YS，Ming Z.Targeted expression of maspin in tumor vasculartures induces endothelial cell apoptosis［J］.Oncogene，2005，24(12):2008-2019.

［17］Lee SJ，Jang H，Park C.Maspin increases Ku70 acetylation and Baxmediated cell death in cancer cells［J］.Int J Mol Med，2012，29(2):225-230.

［18］ZhangW，ShiHY，Zhang M.Maspin overexpressionmodulates tumor cell apoptosis through the regulation of Bcl-2 family proteins［J］.BMC Cancer，2005，5:50-61.