甲醛對大蒜根尖分生組織的毒性效應

李 亞 琳

(1．渭南師范學院 化學與生命科學學院，陜西 渭南714000;2．陜西省多河流濕地生態環境重點實驗室，陜西渭南714000)

甲醛(Formaldehyde)是重要的化學藥劑和致癌物質．近幾年，由于建筑結構的變化以及新型裝修材料的使用，導致室內空氣中有害物質不斷上升，而甲醛是室內空氣污染的主要來源之一．早在2004年，國際癌癥研究機構已經把甲醛列為第一類致癌物質［1－3］，而對室內環境污染的監測主要運用理化方法．利用植物檢測環境污染更為簡便、經濟，其結果與動物實驗也具有高度的一致性，因此國際上廣泛運用植物監測系統對環境化學物質進行檢測［4－5］．植物凈化甲醛的報道也很多，但主要是對吸收甲醛的植物種類的篩選、植物吸收甲醛的機理研究以及外界環境因子(溫度、濕度、光照)對植物吸收甲醛的影響［6－8］．這些方法設備昂貴、靈敏度低，而且受影響因素也多，不能正確反映毒性物質實際的生物效應，所以也不能正確評估污染物的實際毒效應和多種污染物的綜合效應．

大蒜(Allium sativum L，Liliaceae)屬百合科蔥屬植物，易于在室內培養，是一種無毒害的、廉價易得的植物．其根尖生長迅速，很容易觀察細胞的有絲分裂．本實驗用不同濃度的甲醛溶液處理大蒜根尖，觀察甲醛對根尖細胞有絲分裂的影響、微核的產生以及染色體畸變，分析大蒜對甲醛的毒性效應，探討大蒜作為甲醛污染指示植物的可行性．

1 實驗儀器和方法

1．1 實驗材料

1．1．1 材料與儀器

大蒜(2n=16)，百合科植物，購于農貿市場;培養皿、量筒、容量瓶、恒溫箱、移液管、膠頭滴管、水浴箱、培養皿、冰箱、載玻片、蓋玻片、吸水紙、顯微鏡．

1．1．2 試劑

(1)甲醛溶液;

(2)卡諾固定液:(甲醇∶冰醋酸=3∶1);

(3)1 mol/L鹽酸;

(4)改良苯酚品紅染色液:

原液A:取3 g堿性品紅溶于100 mL 70%酒精中，此液可以長期保存．

原液B:取A液1 mL加入9 mL 5%苯酚(即石炭酸)水溶液中(2周內使用)．

原液C:取B液5．5 mL加入0．6 mL的冰醋酸和0．6 mL 38%的甲醛(可長期保存)．

染色液:取C液1～2 mL，加入8～9 mL 45%醋酸和0．15 g山梨醇．放置2周后使用，染色效果顯著，可普遍用于植物組織的壓片法和涂片法．山梨醇為助滲劑，兼有穩定染色液的作用．

1．2 實驗方法

1．2．1 分組

設3個處理組和一個對照組，處理組甲醛濃度分別為0．1%、0．3%和0．5%，對照組用蒸餾水代替．處理時間為24 h、48 h、72 h 和 96 h．

1．2．2 材料培養

將一顆完整無損的大蒜(除去老根)去外皮放在培養皿中用蒸餾水培養，并放在25℃的恒溫箱中，每天按時換水兩次．當大蒜根長至1 cm時，選取根長一致、大小均勻的蒜瓣分成4組，轉移到盛有不同濃度甲醛溶液的培養皿中，分別染毒24 h、48 h、72 h和96 h，對照組直接用蒸餾水培養．

1．2．3 過程

(1)固定:剪取根尖1～2 cm長，用蒸餾水沖洗，然后放入卡諾固定液中固定24 h．

(2)保存:用蒸餾水沖洗固定過的大蒜根尖4次，放入70%乙醇中，置于冰箱4℃保存，以供細胞分裂行為觀察．

(3)解離:用1 mol/L的鹽酸60℃水浴軟化大蒜根尖8～10 min左右，用蒸餾水多次沖洗．

(4)切片制作:將以上處理的根尖置于潔凈的載玻片上，用刀片將根冠和伸長區切除，只留乳白色的分生區．用眼科鑷子輕輕將根尖分生區搗碎，滴加一滴改良苯酚品紅染液，染色5～10 min后，蓋上蓋玻片，輕壓蓋玻片，把材料壓成均勻的薄層，用吸水紙吸干蓋玻片周圍染液，制成臨時切片．

(5)鏡檢:常規壓片，在40×10倍顯微鏡下觀察，統計大蒜根尖有絲分裂的細胞數目，計算其有絲分裂指數(有絲分裂指數=細胞分裂個數/細胞總數)．每個處理觀察3個根尖，每個根尖觀察300個細胞，統計分裂指數(MI)．

1．3 微核及染色體畸變的觀察

用奧特顯微鏡對細胞形態進行觀察并拍照，觀察微核的產生及染色體畸變情況．

1．4 統計學分析

表1中的數值代表3次獨立試驗的平均值(means±S)，結果用方差分析及t檢驗．

2 結果與分析

2．1 甲醛對大蒜根尖細胞有絲分裂的影響

有絲分裂指數是判斷細胞毒性效應的重要參考指標．由表1可見，不同濃度的甲醛溶液處理后，大蒜根尖細胞的分裂指數均明顯降低，與對照組比較具有顯著性差異(p＜0．05)．隨著甲醛濃度的升高，有絲分裂指數也逐漸降低(p＜0．05)．

表1 甲醛溶液對大蒜根尖細胞有絲分裂的影響

由表1可以看到，隨著處理時間的延長，有絲分裂指數有減小的趨勢．與對照組相比，不同時間處理組與對照組均有顯著性差異(p＜0．05)，說明處理時間越長，甲醛對大蒜根尖細胞有絲分裂的影響也越大．

2．2 甲醛對大蒜根尖細胞形態的影響

由圖1可見，對照組根尖細胞有絲分裂數目較多，細胞形態規則，排列整齊，見圖1(A)．甲醛侵染大蒜后，隨著甲醛濃度的增加，明顯觀察到大蒜根尖細胞有絲分裂的數目減少．而且染色體的形態變化也很明顯，在低濃度處理下，很多細胞核里的染色體團聚在一起，染色較深，細胞不能正常分裂，見圖1(B)．隨著甲醛濃度的增加，細胞核里的染色體逐漸分解，因而細胞核染色變淺，有的細胞逐漸解體，見圖1(C、D)．A

圖1 不同濃度的甲醛溶液對大蒜根尖細胞形態的影響

2．3 甲醛對大蒜根尖細胞染色體畸變的影響

觀察發現不同濃度的甲醛溶液處理后，大蒜根尖細胞都不同程度地產生了微核(圖1)．而且甲醛濃度越大，微核產生得越多．

2．4 甲醛處理對大蒜根尖和莖尖生長的影響

實驗測量分析了甲醛處理不同時間后大蒜根尖和莖尖的生長情況．結果顯示，不同濃度的甲醛溶液處理后，均明顯抑制大蒜的根尖和莖尖生長．與對照相比較，不同濃度甲醛處理96 h后，莖的平均生長量分別為85．6%、74．25% 和 67．8%;根的平均生長量分別為 61．94%、59．68% 和 57．1%，差異極其顯著(p＜0．05)，統計結果見表2．從表2還可以看出，甲醛對大蒜根生長的抑制作用更明顯．

3 討論

植物根尖有絲分裂指數可以作為監測環境中甲醛含量的參考指標．本實驗中，大蒜根尖細胞有絲分裂指數隨著處理甲醛溶液濃度的增高以及處理時間的延長而降低．顯而易見，甲醛濃度越大、處理時間越長，它在植物體內累積得就越多，其毒性越強，抑制作用也越明顯．

實驗觀察到不同濃度的甲醛溶液都能引起染色體畸變，并且隨著甲醛濃度的升高，畸變程度也越嚴重．甲醛阻礙細胞分裂，導致有絲分裂指數下降的原因，可能是因其抑制了有絲分裂相關蛋白的合成．若甲醛毒性導致染色體復制異常或染色體受損或紡錘絲的破壞，則在有絲分裂后期，兩組染色體就不能正常分開，進而損傷的染色體發生融合而團聚在一起［9－10］，出現了凝聚．本實驗也觀察到，低濃度甲醛處理后，細胞核深染，說明染色體發生了凝聚．

表2 甲醛處理對大蒜根尖和莖尖生長的影響

微核(micronucleus)，也叫衛星核，是真核類生物細胞中的一種異常結構，是染色體畸變在間期細胞中的一種表現形式．微核的產生是由外界毒性物質作用細胞后，導致細胞染色體丟失或斷裂，從而在胞漿中形成一個或數個小核．本研究發現不同濃度的甲醛均能引起染色體畸變．田秋元［11］和韋立秀［12］曾報道，蠶豆根尖細胞對大氣中的甲醛非常敏感，當甲醛濃度為2．85 mg/m3時，蠶豆根尖細胞微核率就明顯高于對照，達到極顯著差異水平．隨著甲醛處理時間的延長，蠶豆幼根細胞微核率明顯升高，微核率與處理時間之間呈現明顯的正相關關系．本實驗中，不同濃度的甲醛處理均能刺激微核的產生，在分裂后期個別染色體有滯后現象，這些落后的染色體逐漸解體，形成大小不一的微核．

在正常生長情況下，大蒜根尖和莖尖以正常速度生長．但是甲醛是一種毒性很強的液體，甲醛處理會對大蒜根尖和莖尖生長起到抑制作用．這可能是由于甲醛溶液使根尖和莖尖細胞分裂分化受阻，生長點部分壞死．由于根尖細胞直接接觸甲醛溶液，因此實驗觀察到甲醛處理對大蒜根尖生長的抑制作用明顯大于對莖尖生長的影響．

甲醛對人類健康的危害人盡皆知，而甲醛對植物也產生很強的毒性效應．當植物體內積聚的甲醛數量超過植物自身的凈化能力時，植物就會不同程度受傷，如萎焉、葉黃、生長緩慢甚至死亡等．本研究以染色體大而清晰、便于觀察的大蒜根尖為材料，研究了不同濃度的甲醛溶液對大蒜根尖細胞有絲分裂以及根尖和莖尖生長的影響和微核的產生，明確了大蒜是對甲醛毒性比較敏感的植物種類之一，證明甲醛對大蒜根尖細胞有明顯的毒性效應，其根尖細胞有絲分裂指數可作為監測環境甲醛含量的參考指標．

［1］梁寶生．我國甲醛室內空氣質量標準建議值的探討［J］．重慶環境科學，2003，25(12):193－194．

［2］田世愛，于自強，張宏．室內甲醛污染狀況調查及防治措施［J］．潔凈與空調技術，2005，(1):41．

［3］石碧清，劉湘，閭振華．室內甲醛污染現狀及其防治對策［J］．環境科學與技術，2007，30(6):49－52．

［4］GrantWF．Higher plantassays for the detection of chromosomal aberrations and genemutations-a briefhistorical background on their use for screening and monitoring environmental chemicals［J］．Mutat Res，1999，426(2):107 － 112．

［5］Kanan ya N，Gill B S，Grover IS．Vicia faba chromosomal aberration assay［J］．Mutat Res，1994，3(2):231 －247．

［6］王光學，王蕓，嚴彥．木質板材釋放的甲醛對蠶豆根尖細胞微核的影響［J］．中國環境科學，2003，23(1):38－41．

［7］王利英，楊振德，鄧榮艷．幾種園林植物對甲醛污染的反應研究［J］．廣西科學，2007，14(2):163－166．

［8］安雪，李霞，潘會堂，等．16種室內觀賞植物對甲醛凈化效果及生理生化變化［J］．生態環境學報，2010，19(2):379－384．

［9］高揚，武法清，何正飚．鉛對洋蔥根尖細胞有絲分裂的影響［J］．長春師范學院學報，2003，22(5):57－59．

［10］毛學文，王弋博．氯化鉛對豌豆根尖細胞微核和異常分裂的作用(簡報)［J］．植物生理學通訊，2001，37(5):406．

［11］田秋元，高鵬修．甲醛誘變大豆根尖細胞的微核效應研究［J］．安徽農業科學，2005，33(9):1688－1689．

［12］韋立秀，孫艷娟，楊振德，等．甲醛污染對蠶豆根尖細胞微核的誘導作用［J］．環境科學與技術，2009，32(4):33－36．