氣相色譜－質譜聯用法測定14種食用植物油中的植物甾醇

楊春英 劉學銘 陳智毅 楊榮玲 林耀盛 趙曉麗

(廣東省農產品加工公共實驗室廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所/農業生物技術研究所，廣州 510610)

植物甾醇(Phytosterol，plant sterol)是一種天然的植物活性物質，廣泛存在于各種植物油、種子和堅果中，也存在于部分蔬菜水果中［1］。植物甾醇的結構與膽固醇相似［2］，為環戊全氫菲的3－羥基化合物，C－5上有雙鍵的稱甾醇，C－5飽和的稱甾烷醇。常見4種植物甾醇為豆甾醇、β－谷甾醇、菜籽甾醇和菜油甾醇，其化學結構如圖1所示。四種甾醇的區別在于支鏈大小和雙鍵數目不同。

圖1 4種植物甾醇結構式

研究證明，植物甾醇具有降血脂［3－4］、防治前列腺肥大、抗腫瘤、類激素、提高免疫力等多種生理功能［5］，在西方很多國家將其應用于人群慢性病預防。近20年來，國內外學者日益重視植物甾醇的研究，開展了食物中植物甾醇的含量測定及功能評價工作，并將其作為功能食品的一種添加劑［6－7］。傳統測定植物甾醇的方法如重量法、比色法及酶法等，只能測定甾醇總量，不能實現對具體某一甾醇進行定性和定量分析［8］;近年報道的方法主要有薄層色譜法［9］(TLC)、高效液相色譜法［10］(HPLC)、氣相色譜法［11］(GC)和氣相色譜 － 質譜法［12］(GC － MS)等。由于GC法具有快速簡便、靈敏度高和分離效果好等優點，再加上MS的定性效果較好，故本試驗在前人研究的基礎上，優化了食用植物油中甾醇測定的GCMS法，樣品皂化后無需衍生，可直接進樣分析。同時對14種食用植物油的4種植物甾醇含量進行了分析，為合理選用食用油和食用油品質評價提供了依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油茶籽油、花生油、葡萄籽油、芝麻油、大豆油、菜籽油、玉米油、葵花籽油、橄欖油、花椒籽油、辣椒油、芥末油、姜油和大蒜油:市售，其中，花椒籽油、辣椒油、芥末油、姜油和大蒜油均為以植物油為基礎添加辛香料的調味油。

豆甾醇、β－谷甾醇、菜籽甾醇和菜油甾醇標準品:美國Chromadex公司;色譜純無水乙醇，優級純氫氧化鉀和無水硫酸鈉，其余試劑均為分析純，所用水為超純水。

6890N/5975B氣相色譜－質譜聯用儀:美國Agilent Technologies有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 分析條件

1.2.1.1 氣相色譜條件

色譜柱:J＆W DB－5MS UI毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm);進樣口溫度:300 ℃;進樣量:1.0 μL，分流比為 20∶1;載氣:高純氦氣，流速為 1.0 mL/min;程序升溫:初始溫度180℃，以15℃/min升溫速率升至280℃，保持25 min。

1.2.1.2 質譜條件

EI離子源，電子能量70 eV;離子源溫度230℃;四極桿溫度計150℃;傳輸線溫度280℃;質量范圍30～550 amu，全掃描方式;溶劑延遲2 min。

1.2.2 樣品處理

準確稱取2.000 0 g植物油于100 mL具塞三角瓶中，分別加入30 mL無水乙醇，2.5 mL 20% 抗壞血酸溶液，3.00 mL50%氫氧化鉀溶液，置80℃水浴邊加熱邊震蕩40 min使其皂化，皂化完全后立即將皂化試液放入冰水浴中冷卻。將皂化試液轉移至250 mL分液漏斗中，用40 mL超純水分3次洗滌皂化用的三角瓶，洗液并入分液漏斗中。加入40 mL乙醚萃取，重復3次，合并乙醚萃取液，用超純水洗滌至中性，過無水硫酸鈉除去殘留水分。萃取液于50℃水浴中減壓濃縮并回收乙醚，殘渣用少量乙醚洗至5 mL帶刻度試管中，氮氣吹干，殘留物用2.00 mL無水乙醇復溶，經0.22 μm微孔濾膜過濾后進GC－MS分析。

1.2.3 定性和定量分析

植物甾醇的定性方法采用保留時間、標準品比對和質譜庫檢索(NIST05a.L)方法;定量分析采用外標法，依據總離子流圖峰面積計算每種植物甾醇的絕對含量。

2 結果與討論

2.1 標準曲線和檢測限

分別準確稱取一定量上述4種植物甾醇標準品，加入無水乙醇溶解，10 mL棕色容量瓶定容，配制成標準儲備液，再逐級稀釋配制成系列標準工作液。按照上述分析條件進行檢測。以峰面積Y對植物甾醇濃度X進行線性擬合，檢出限按S/N=3計算，結果見表1和圖2?？梢?，在本試驗條件下，4種植物甾醇在選定的濃度范圍內具有的線性關系(R≥0.999 2)，方法檢測限(分流進樣)均在8.62 mg/L以下，采用不分流進樣檢測限將更低。

表1 4種植物甾醇曲線方程及檢出限(濃度范圍20～500 mg/L)

圖2 4種植物甾醇標準曲線

2.2 精密度和回收率

為檢驗該方法對實際樣品的適應性，采用標準品加入法。按上述方法測定，對選取的植物油樣品進行了加標回收試驗，每種水平分別做7份平行試驗，計算平均回收率和相對標準偏差，4℃冰箱放置24 h后再測定，計算其日間變異系數，結果見表2。結果表明，標準加入的回收率較高(89.4%～106.8%)，RSD小于5.50%，24 h內測定結果無顯著變化。

表2 加標回收試驗結果(n=7)

2.3 皂化條件的確定

試驗在參考國內外研究基礎上［13－15］，選用50%氫氧化鉀和無水乙醇混合液對樣品進行皂化。試驗選取花生油為代表，考察了不同的皂化溫度(65、70、75、80、85 ℃)、皂化時間(35、40、50、60 min)及皂化劑用量對花生油皂化程度的影響，結果表明:樣品在80℃水浴條件下，皂化40 min即可皂化完全，無水乙醇和50%氫氧化鉀溶液用量分別為30.00 mL和3.00 mL。

2.4 最佳色譜分離條件

J＆W DB－5MS UI毛細管色譜柱具有超高惰性，特別低的色譜柱流失，對難以分離的活性化合物有良好的峰形。研究選用J＆W DB－5MS UI毛細管GC柱，考察了進樣口溫度、進樣模式、分流比、初始溫度及升溫程序的影響，最終確定1.2.1所述分析條件，可在32 min內實現植物甾醇與其他不皂化物的分離，如圖3所示?？梢姡狙芯拷⒌姆椒蓪崿F待測組分和干擾組分的良好基線分離。

圖3 玉米油不皂化物總離子流圖

2.5 植物油樣品中甾醇的測定與分析

利用上述方法，對市售14種食用植物油中的4種植物甾醇進行了分析，結果見表3。

由表3可知，植物油種類不同，其4種植物甾醇的含量、比例以及總量各不相同。大多數植物油中β－谷甾醇質量分數居高，在47.5%～89.4%之間，其中，β－谷甾醇以橄欖油的質量分數最高，達89.4%;其次為菜油甾醇，10.6%～54.5%之間，其中以菜籽油含量最高，占4種植物甾醇總量的54.5%，高于β－谷甾醇含量。同一種類不同品牌的植物油中4種植物甾醇比例基本接近，說明植物甾醇含量比例關系主要取決于原料，這與文獻報道一致［11］;但總量存在一定的差異，可能與生產工藝、精煉方法、儲藏條件及原料品種等多種因素有關。

在純品植物油中，菜籽油和玉米油的4種植物甾醇總量最高，約5 000 mg/kg，其次是芝麻油;茶油和橄欖油的植物甾醇含量最低，這與該植物油不皂化物含量(≤1.5%)低有關;除玉米油和菜籽油外，其余植物油中均未檢測到菜籽甾醇;茶油中的豆甾醇含量較高(26.9%～28.4%)，高于菜油甾醇，其余植物油中質量分數均小于15%;根據國際食品法典標準［16－17］對各種植物油甾醇總量和組成范圍規定，4種植物甾醇的含量及其總量基本在規定范圍內，可見，采集的樣品真實性和可靠性強，測定結果準確性高。

表3 植物油甾醇含量測定結果(n=3)

5種調味油中姜油的甾醇含量最高，與玉米油和菜籽油含量接近，辣椒油和芥末油含量基本一致，由于原料同時含有植物甾醇，未能推測調味油中的植物甾醇來源于原料或者選用的植物油。

除上述4種植物甾醇外，同時檢測到少量其他植物甾醇(圖4，括號內數值表示相似度)，主要包括麥角甾烷醇、羊毛甾醇、豆甾二烯醇、禾本甾醇、α－香樹脂醇、Δ7－豆甾烯醇、環阿屯醇。鑒定依據NIST05a.L質譜庫檢索，以相似度 ＞85(最大值為100)確認為該物質。由圖可見，不同植物油其植物甾醇組成不同，由于試驗條件限制，缺乏標準品，暫未能對上述7種植物甾醇進行準確定量分析。

圖4 玉米油和葵花籽油總離子流圖片段

2.6 聚類分析

以4種植物甾醇絕對含量為變量、以平方歐氏距離為度量準則、以組間連結法(between－group linkage)為組群合并準則，用SPSS19.0軟件對14種25個植物油樣品進行了系統聚類分析。結果見圖5。

圖5 植物油基于植物甾醇組成的聚類樹狀圖

圖5的分析結果表明:不同品牌的同一種植物油均可歸為同一類別，說明同種植物油的植物甾醇組成相似，與直觀的結果分析一致。經過聚類分析后，橄欖油獨為一類，其植物甾醇組成與其他植物油之間存在明顯的差異;其余13種植物油可分為兩大類:其中菜籽油獨為一類，說明其與組內其他樣本差異較大，葡萄籽油等12種23個植物油樣品為第二大類，說明組內植物油的植物甾醇組成具有相似性。第二大類中茶油并未歸為任何亞類中，說明其與所在大類中其他樣本存在一定差異性，其余11種植物油又可分為兩大亞類，花生油、芝麻油、葵花籽油和葡萄籽油為第一亞類;玉米油等7種植物油為第二亞類。第一亞類又可細分為兩小類，8個品牌花生油為一類，說明花生油與第一亞類組內的其他成員既有相似性又有所差別。姜油、大蒜油、芥末油、花椒油和辣椒油均為調和油，其植物甾醇組成與花生油、芝麻油等純品植物油存在差異，故劃分為同一類別，玉米油和大豆油經聚類后與上述調和油劃分為同一大類，說明組內成員之間有相似之處，分析其原因可能是調和油的配料組成不明確，選用的植物油可能是一種或多種。

3 結論

本研究建立了GC－MS測定食用植物油中植物甾醇含量的方法，并對常見14種食用植物油中的4種植物甾醇進行了分析，方法準確度高，重現性好、適用性強，通過保留時間和質譜定性，可準確地測定植物甾醇的含量。通過系統聚類和直觀分析，初步認為不同品牌的同種植物油的4種植物甾醇比例具有一致性，為食用油的品質鑒定和營養評價提供了科學依據，同時為消費者的膳食合理搭配提供了參考，人們可根據自身需要，選用合適的植物油來增加總植物甾醇或某種植物甾醇的攝入量，以達到預防疾病的作用。

［1］Moghadasian M H，Frohlich J J.Effects of dietary phytosterols on cholesterol metabolism and atherosclerosis:clinical and experimental evidence ［J］.The American Journal of Medicine，1999，107(6):588 －594

［2］Sabeva N S，Mxphaul C M，Li X G，et al.Phytosterols differentially influence ABC transporter expression，cholesterol efflux and inflammatory cytokine secretion in macrophage foam cells［J］.Journal of Nutritional Biochemistry，2011，22(8):777－783

［3］Micallef M A，Garg M L.Beyond blood lipids:phytosterols，statins and omega－3 polyunsaturated fatty acid therapy for hyperlipidemia ［J］.Journal of Nutritional Biochemistry，2009，20(12):927 －939

［4］Marangoni F，Poli A.Phytosterolse and cardiovascular health［J］.Pharmacological Research，2010，61(3):193 －199

［5］Ferreetti G，Bacchetti T，Masciangelo S，et al.Effect of phytosterols on copper lipid peroxidation of human low－density lipoproteins［J］.Nutrition，2010，26(3):296 －304

［6］Yang H J，Yan F，Wu D G，et al.Recovery of phytosterols from waste residue of soybean oil deodorizer distillate［J］.Bioresource Technology，2010，101(5):1471 －1476

［7］Rocco A，Fanali S.Analysis of phytosterols in extra － virgin olive oil by nano－liquid chromatography［J］.Journal of Chromatography A，2009，1216(43):7173 －7178

［8］梁博，郭璇華.分光光度法測定火龍果莖中的植物甾醇［J］.分析試驗室，2008，27(12):379 －381

［9］張麗霞，畢艷蘭，張康逸.植物甾醇與甾醇酯的分離分析方法研究［J］.食品加工與食品機械，2006(2):53－55

［10］Ito N，Ohtsubo T，Kusu F，et al.An ultra performance liquid chromatographic method for determining phytosterol uptake by Caco － 2 cells［J］.Analytical Biochemistry，2012，421(1):86－91

［11］Toivo J，Phillips K，Lampi A M.Determination of sterols in foods:recovery of free，esterified and glycosidic sterols［J］.Journal of Food Composition and Analysis，2001，14:631 －643

［12］Balme S，Güla9ar F O.Rapid screening of phytosterols in orange juice by solid－phase microextraction on polyacrylate fibre derivatisation and gas chromatographic－mass spectrometric［J］.Food Chemistry，2012，132(1):613 －618

［13］李寧，趙玉蘭，廖杰.HPLC法測定茶籽、果殼、茶籽油中脂溶性維生素和β－胡蘿卜素的含量［J］.現代科學儀器，2009(5):92－94

［14］楊虹，姜元榮，魏婷婷，等.食用油中植物甾醇測定方法的優化及含量分析［J］.中國糧油學報，2011，26(2):120－123

［15］Schwartz H，Ollilainen V，Piironen V，et al.Tocopherol，tocotrienol and plant sterol contents of vegetable oils and industrial fats［J］.Journal of Food Composition and Analysis，2008，21(2):152 －161

［16］CODEX STAN 33 －1981，Rev.2 －2003，Codex standard for olive oil and olive pomace oils(1)［S］

［17］CODEX STAN 210，Amended 2005，Codex standard for named vegetable oils［S］.