溫和堿氧化處理對花生殼酶解效果的影響

劉朝龍 王雨生，2 陳海華

(青島農業大學食品科學與工程學院1，青島 266109)

(青島農業大學學報編輯部2，青島 266109)

我國是花生的生產大國，年產花生約12 000 kt，其中花生殼約占花生果重的30%［1］，花生殼中含有65%～80%的粗纖維［2］。因其纖維素結構中有復雜的無定形區、結晶區和微纖維［3］，尤其是結晶區不存在游離的羥基，因此要高效利用花生殼中的纖維素就必須破壞花生殼纖維素的結晶結構，使纖維素易被酶解。目前，主要以物理法、化學法、生物法、聯合預處理等4大類方法對纖維素原料進行預處理［4］。單一的預處理方法通常存在較多的缺點，因而多因素聯合預處理方法的研究成為近年來的研究熱點［5－6］。其中，溫和堿氧化法是一種新興的多因素聯合預處理方法。它同時使用NaOH和H2O2，可有效去除纖維原料中的半纖維素和木質素，釋放纖維素，提高纖維素的酶解效果［7－8］。目前盡管已有關于溫和堿氧化試劑回收及循環利用的專利［9］，但是國內采用溫和堿氧化法處理纖維素原料的研究報道比較少見。姚秀清等［10］利用溫和堿氧化法處理脫蠟的秸稈樣品，對總糖回收率和木質素去除率作了回歸分析，并最終確定了優化條件。王洋等［11］采用超聲波輔助溫和堿氧化法對小麥秸稈進行預處理，建立了各試驗因素與處理后木質素相對含量關系的數學模型。目前尚未見到關于溫和堿氧化處理花生殼的研究報道。

我國每年有大量花生殼被廢棄，造成極大的資源浪費。若能采用溫和堿氧化法對其進行適當處理后酶解，可制得還原糖液，為后續發酵生產乙醇或生產熱反應香精提供原料，變廢為寶。

本試驗主要采用溫和堿氧化法(NaOH－H2O2)對花生殼進行預處理，并對溫和堿氧化法的作用條件進行優化，以期為花生殼纖維素的預處理方法提供理論依據，并為后續花生殼纖維素的酶解做好準備。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

花生殼、纖維素酶(2×104U/g):康地恩生物科技有限公司;其他試劑均為分析純。

1.2 試驗設備

DELTA320pH計:梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司;DHG－9070A型電熱鼓風干燥箱:上海精宏實驗設備有限公司;紫外/可見分光光度計:上海光譜儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 溫和堿氧化處理工藝條件的單因素試驗

先將花生殼清洗3次，除去雜質，在105℃下的干燥箱內烘干，粉碎、過80目篩。稱取一定質量經清洗、除雜過的花生殼粉末，分別經下述處理后，冷卻，3 000 r/min離心20 min，棄去上清液，沉淀洗滌至中性后于105℃下的干燥箱內烘干，粉碎、過100目篩，密封保存，留待酶解。

NaOH質量分數對預處理效果的影響:按液固比15∶1加入質量濃度分別為2～10 g/100 mL的NaOH溶液，在40℃水浴中攪拌處理2.0 h。

H2O2體積分數對預處理效果的影響:按液固比15∶1加入體積分數分別為1% ～5%的H2O2溶液，在40℃水浴中攪拌處理2.0 h。

VNaOH與VH2O2比例對預處理效果的影響:按液固比 15∶1 加入 VNaOH:VH2O2分別為 9∶1、7∶1、5∶1、3∶1、1∶1的NaOH－H2O2混合溶液，在40℃水浴中攪拌處理 2.0 h。

液固比對預處理效果的影響:分別按液固比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 加入 VNaOH:VH2O2為 5∶1的NaOH－H2O2混合溶液，在40℃水浴中攪拌處理2.0 h。

預處理溫度對預處理效果的影響:按液固比15∶1加入 VNaOH:VH2O2為 5∶1 的 NaOH － H2O2混合溶液，分別在 40、50、60、70、80 ℃ 水浴中攪拌處理2.0 h。

預處理時間對預處理效果的影響:按液固比15∶1加入 VNaOH:VH2O2為 5∶1 的 NaOH － H2O2混合溶液，在50℃水浴中分別攪拌處理2.0～10.0 h。

1.3.2 溫和堿氧化處理工藝條件的響應面試驗

響應面試驗的設計:基于單因素試驗所初步確定的溫和堿氧化處理的單因素條件，采用響應面法在3因素、3水平上對溫和堿氧化條件進行優化，試驗設計的因素及水平設計見表1。

表1 響應面優化因素與水平

1.3.3 傳統酸法或堿法對花生殼纖維素的預處理

稱取一定質量經清洗、除雜的花生殼粉末，按液固比15∶1，經體積分數為1%的HCl溶液在60℃水浴中攪拌處理1.0 h，或者經質量濃度為8 g/100 mL的NaOH溶液在40℃水浴中攪拌處理1.0 h后，冷卻，3 000 r/min離心20 min，棄去上清液，沉淀洗滌至中性后于105℃下的干燥箱內烘干，粉碎、過100目篩，密封保存，留待酶解。

1.3.4 花生殼的酶解

稱取一定質量預處理后的花生殼粉，加入一定體積的蒸餾水，使液固比為15∶1，調節至pH 4.5，加入一定量的體積分數為1%的纖維素酶，攪拌均勻，在50℃下酶解6.0 h，酶解結束后，進行沸水浴滅酶20 min，使酶失活，自然冷卻，3 000 r/min離心20 min，所得上清液即花生殼酶解液。

1.3.5 酶解液還原糖含量的測定

采用DNS法［12］測定酶解液中的還原糖含量。

1.3.6 酶解率的測定

酶解率(簡稱DH)，是指酶解液中還原糖總量占酶解前樣品中纖維素總量的百分比，按如下公式計算:

1.4 數據處理

利用Design Expert 8.05b軟件的多元線性回歸分析程序對試驗結果進行處理。

2 結果與分析

2.1 溫和堿氧化單因素條件對預處理效果的影響

2.1.1 NaOH質量濃度對預處理效果的影響

由圖1可以看出，隨NaOH質量濃度的升高，花生殼纖維素酶解率顯著增加，當NaOH質量濃度超過8 g/100 mL后，酶解率增加緩慢。這可能是因為當NaOH質量濃度增大到一定水平時，NaOH對纖維素的潤脹作用接近極限，因而酶解率增加緩慢。綜合考慮，溫和堿氧化處理花生殼時適宜的NaOH質量濃度為8 g/100 mL。

圖1 NaOH質量濃度對花生殼酶解率的影響

2.1.2 H2O2體積分數對預處理效果的影響

由圖2可知，隨著H2O2體積分數的升高，花生殼酶解率呈現先上升后下降的趨勢，H2O2體積分數為4%，花生殼的酶解率達到最大值。這可能是因為H2O2體積分數在一定范圍內，能充分氧化木質素及其降解所產生的酚類物質，釋放更多的纖維素，有利于纖維素酶解反應［8］;當H2O2體積分數超過一定限度，可能導致部分纖維素氧化破壞，酶解率降低［7］。綜合考慮，溫和堿氧化處理花生殼時適宜的H2O2體積分數為4%。

圖2 H2O2體積分數對花生殼酶解率的影響

2.1.3 VNaOH與 VH2O2比例對預處理效果的影響

由圖3可知，隨著VNaOH與VH2O2比例的減小，花生殼酶解率呈現先上升后下降的趨勢，當VNaOH與VH2O2比例為5∶1時，花生殼的酶解率達到最大值。當VNaOH與VH2O2比例在一定范圍內，NaOH的潤脹作用占據優勢，有利于纖維素的釋放，促進纖維素的酶解;但是，當VNaOH與VH2O2比例的降低至某一范圍后，NaOH對纖維素的潤脹作用逐漸不明顯，H2O2作用的有限性越來越明顯，導致花生殼纖維素酶解率降低。綜合考慮，溫和堿氧化處理花生殼時適宜的VNaOH與VH2O2比例為 5∶1。

圖3 VNaOH與VH2O2比例對花生殼酶解率的影響

2.1.4 液固比對預處理效果的影響

由圖4可知，在一定范圍內，隨著液固比的升高，花生殼酶解率呈現先上升后下降的趨勢，液固比為15∶1時酶解率達到最大值，超過25∶1后，酶解率反而會降低。綜合考慮，溫和堿氧化處理花生殼時適宜的液固比為15∶1。

圖4 液固比對花生殼酶解率的影響

2.1.5 預處理溫度對預處理效果的影響

由圖5可知，在一定范圍內，隨著預處理溫度的升高，花生殼酶解率呈現先上升后下降的趨勢。當溫度在一定范圍內(低于50℃)升高時，由于分子運動程度加劇，使得NaOH與H2O2對花生殼纖維素的預處理效果增強;但是，隨著溫度的繼續升高，H2O2分解速率加快，使其作用減弱，因而預處理效果變差。在本試驗中，當預處理溫度為50℃時花生殼纖維素的酶解率最高，所以溫和堿氧化處理花生殼時的適宜溫度為50℃。

圖5 預處理溫度對酶解率的影響

2.1.6 預處理時間對預處理效果的影響

由圖6可知，隨預處理時間的延長，花生殼酶解率呈現微弱的先上升后下降的趨勢。這可能是由于最初隨著預處理時間的延長，增加了NaOH、H2O2與木質素半纖維素的作用時間，兩者與木質素半纖維素充分接觸，提高了預處理效果，利于花生殼纖維素的酶解;但是隨著預處理時間的繼續延長，由于H2O2自身分解，其預處理效果減弱，使得花生殼纖維素酶解率降低［13］。當預處理時間為2.0 h時，花生殼纖維素的酶解率達到27.57%，在2.0 h以后，預處理時間對預處理效果的提高并不明顯。考慮到經濟成本，選擇花生殼溫和堿氧化處理的適宜時間為2.0 h。

圖6 預處理時間對花生殼酶解率的影響

2.2 預處理條件的響應面優化分析

響應面優化試驗方案及結果見表2。

表2 響應面優化試驗方案及結果

由表3中回歸模型及方差分析結果可知，此模型的P＜0.01，回歸模型達到極顯著水平。其中，X1、X2、X1X2、X1X3、X12、X22、X327 項 P ＜ 0.01，它們對響應值Y的影響極顯著，其余項對Y不構成顯著影響。失擬項各項數據表明該模型失擬不顯著，說明該回歸方程能較好的擬合真實的響應面［14］。相關系數R2=0.992 7，說明該回歸方程擬合情況非常好，能夠解釋絕大多數因變量變化。

根據試驗結果，用Design Expert 8.05b軟件對試驗數據進行回歸分析，得出酶解率與各因子之間的二次線性回歸方程為:

Y=27.41+0.556X1+2.624 X2+0.398 X3－1.243X1X2－1.145 X1X3+0.135 X2X3－1.146X12－1.88X22－1.214 X32

通過比較回歸方程一次項系數絕對值的大小，可以判斷各因子對花生殼纖維素酶解率影響的主次性［15－17］，即花生殼預處理的過程中，處理溫度對花生殼纖維素酶解率的影響最大，其次是處理時間，最后是 VNaOH∶VH2O2。

表3 回歸模型方差分析表

圖7 VNaOH∶VH2O2與預處理溫度對酶解率影響的響應曲面和等高線圖

交互因素對花生殼纖維素酶解率影響的響應曲面和等高線圖如圖7～圖9所示。由回歸方程的偏回歸系數顯著性檢驗、交互因素的響應曲面和等高線圖可知各因素之間的交互作用［18］，即X1(VNaOH∶VH2O2)與 X2(處理溫度/℃)之間以及 X1(VNaOH∶VH2O2)與X3(處理時間/h)存在極顯著的交互效應(P12=0.000 1 ＜0.01，P13=0.000 2 ＜0.01)。

經響應面分析得出花生殼預處理的最佳工藝條件為:VNaOH∶VH2O2為 4.6∶1，處理溫度 58 ℃，處理時間2.2 h，預測的花生殼纖維素的酶解率為28.50%。在上述試驗條件下進行驗證試驗，得到的花生殼纖維素的酶解率為28.48%，與計算機模擬值基本接近，表明預測值和真實值之間有很好的擬合性，進一步驗證了模型的可靠性。

2.3 溫和堿氧化法與傳統預處理方法效果的比較

溫和堿氧化法與傳統預處理方法對花生殼纖維素預處理效果的比較如表4所示。

表4 溫和堿氧化法與傳統預處理方法對花生殼纖維素酶解率的影響

由表4可知，溫和堿氧化法遠優于傳統的酸/堿預處理方法，可以明顯提高花生殼纖維素的酶解率，進而提高花生殼纖維素的利用率。

3 討論與結論

本試驗以花生殼為原料，采用溫和堿氧化法(NaOH－H2O2)對其進行預處理，為后續酶解花生殼纖維素做準備。結果表明，花生殼溫和堿氧化處理的最佳工藝條件為:VNaOH∶VH2O2為 4.6∶1，處理溫度58℃，處理時間2.2 h。在此預處理條件下花生殼纖維素的酶解率可達28.48%，遠高于經傳統的酸/堿預處理后花生殼纖維素的酶解率。各因素的影響主次順序為:處理溫度＞處理時間＞VNaOH∶VH2O2。

本研究突破了傳統方法對花生殼進行了預處理，而不再只局限于對稻殼、秸稈等纖維素原料的研究。采用遠優于傳統的酸/堿預處理方法的溫和堿氧化法(NaOH－H2O2)對花生殼進行預處理，明顯提高了花生殼纖維素的酶解率，真正變廢為寶。但是，本研究中溫和堿氧化法的氧化劑并未經過細致全面的篩選，過氧化氫是否優于過氧乙酸等其他氧化劑有待進一步探索。另外，本研究只是將溫和堿氧化法與傳統酸/堿預處理方法進行了比較，至于其能否與微波、超聲波等物理方法相結合及結合后預處理效果如何還有待進一步研究。

本試驗研究了溫和堿氧化法對花生殼進行預處理的效果及條件優化，為實現花生殼的再利用提供理論依據，并為工業上預處理花生殼提供參考。

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