基于超弱發(fā)光技術(shù)的稻谷和小麥種子發(fā)芽率檢測(cè)

王春芳 詹 耀 胡菲菲 于 勇 朱松明

(浙江大學(xué)生工系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，杭州 310058)

超微弱發(fā)光(Ultraweak luminescence)，簡(jiǎn)稱超弱發(fā)光，是一種低水平的生物發(fā)光，前蘇聯(lián)科學(xué)家G.Gurwitsh在1923年進(jìn)行著名的“洋蔥試驗(yàn)”中首次發(fā)現(xiàn)了超弱發(fā)光現(xiàn)象。然而，由于儀器條件的限制，直到1954年意大利人Colli等利用裝有光電倍增管的儀器才首次科學(xué)地證明了超弱發(fā)光現(xiàn)象［1］。此后的50多年里，各國(guó)研究人員對(duì)于超弱發(fā)光的機(jī)理及應(yīng)用開(kāi)展了大量研究工作。至今，雖然其發(fā)光機(jī)理尚未揭示清楚，但研究已證明，超弱發(fā)光反映了生物體細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的新陳代謝、功能調(diào)解和信息交換，是生物體生長(zhǎng)代謝的動(dòng)態(tài)指標(biāo)［1－2］。

在所獲得的成果中，植物的超微弱發(fā)光值與其生活力有密切正相關(guān)關(guān)系的發(fā)現(xiàn)是最基礎(chǔ)研究成果之一，也是超弱發(fā)光檢測(cè)技術(shù)用于現(xiàn)代農(nóng)事管理的最重要應(yīng)用基礎(chǔ)之一［3］。研究表明，經(jīng)過(guò)電磁輻射處理的大豆的生活力比未處理的種子大大增強(qiáng)，而同時(shí)其超微弱發(fā)光值也顯著增加;而當(dāng)采用代謝抑制劑處理綠豆種子后，種子活性大大降低，其超微弱發(fā)光值也同時(shí)降低［4］。在對(duì)小麥、豌豆、玉米、蔬菜等的研究中也得到了類似的研究結(jié)果［5－8］。

然而，目前針對(duì)農(nóng)產(chǎn)品超弱發(fā)光的研究還存在一些不足，主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面:一是較少建立有效的通過(guò)農(nóng)產(chǎn)品超弱發(fā)光值預(yù)測(cè)其生活力的模型;二是未對(duì)可能引起農(nóng)產(chǎn)品的超弱發(fā)光值變化的其他因素進(jìn)行剔除，如大分子成分變化，進(jìn)而獲得超弱發(fā)光值與其生活力相關(guān)的直接證據(jù)。這兩方面的不足在目前的稻谷和小麥的相關(guān)研究中表現(xiàn)得尤為突出。

本研究以稻谷和小麥為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)貯藏0(未貯藏，收獲后直接檢測(cè))～24個(gè)月的稻谷和小麥種子顆粒及去種胚后的胚乳粉的超弱發(fā)光分析，建立兩種超弱發(fā)光值與其發(fā)芽率的關(guān)系，探索稻谷和小麥超弱發(fā)光值與其生活力相關(guān)的直接證據(jù)，并建立有效的通過(guò)超弱發(fā)光值預(yù)測(cè)其生活力的數(shù)學(xué)模型。為稻谷和小麥生活力指標(biāo)(發(fā)芽率)的快速判定技術(shù)及裝備的研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

稻谷:浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)收獲的晚粳稻(浙農(nóng)稻1號(hào))(2009年11月收獲)，收獲后采用50℃低溫干燥值貯藏安全含水率［(12.5 ±0.1)%，干基］，并在人工氣候室［溫度(25±1)℃，濕度(50±5)%，機(jī)械通風(fēng)］中貯藏待測(cè)。

小麥:采用浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)收獲的小麥(浙農(nóng)麥3號(hào))(2009年7月收獲)，收獲后采用50℃低溫干燥值貯藏安全含水率［(12.5 ±0.1)%，干基］，并在人工氣候室［溫度(25±1)℃，濕度(50±5)%，機(jī)械通風(fēng)］中貯藏待測(cè)。

1.2 主要儀器

BPCL－2微弱發(fā)光測(cè)量?jī)x:中科院物理所;B6－15人工氣候室:北京易盛泰和科技有限公司;YS－04小型高速粉碎機(jī):北京燕山正德機(jī)械設(shè)備有限公司;DGX－9 003鼓風(fēng)干燥箱:上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;SW－CJ－1F潔凈工作臺(tái):蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;PRX－600C－CO2人工氣候箱:寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 超弱發(fā)光檢測(cè)

采用超微弱發(fā)光測(cè)量?jī)x檢測(cè)稻谷和小麥樣品的超弱發(fā)光(包括種子顆粒樣品和胚乳粉樣品)，通過(guò)預(yù)試驗(yàn)選定超微弱發(fā)光測(cè)量?jī)x的檢測(cè)條件為:樣品檢測(cè)量，10 g;檢測(cè)溫度，(30±1)℃。此外，預(yù)試驗(yàn)表明，稻谷和小麥無(wú)論是種子顆粒樣品還是胚乳粉樣品，放入超微弱發(fā)光測(cè)量?jī)x開(kāi)始檢測(cè)的一段時(shí)間內(nèi)，由于受到外源光照并延遲發(fā)光的作用，其超弱發(fā)光值從初始值逐漸波動(dòng)下降，并在5 min后都可達(dá)到穩(wěn)定發(fā)光(樣品自身的生物發(fā)光)，且這一初始值受到檢測(cè)前外界光照度的影響，而穩(wěn)定發(fā)光階段的超弱發(fā)光值卻不受檢測(cè)前外界光照的影響。因此，試驗(yàn)中設(shè)定每樣品檢測(cè)10 min，并取后5 min的數(shù)據(jù)計(jì)算樣品的超弱發(fā)光值(n/s，每秒檢測(cè)到的光子數(shù))。每樣品檢測(cè)時(shí)，先檢測(cè)樣品與容器的總超弱發(fā)光值N1，再將樣品取出并檢測(cè)空容器的超弱發(fā)光值N2，樣品的實(shí)際超弱發(fā)光值N由式(1)計(jì)算得到。每樣品設(shè)重復(fù)7次。

1.3.2 種子發(fā)芽率測(cè)定

從儲(chǔ)藏0～24個(gè)月的稻谷和小麥種子顆粒樣品中，隨機(jī)挑選100粒種子均勻放置在3張濾紙(預(yù)先在直徑為15 cm的培養(yǎng)皿中用蒸餾水浸泡2 h)上，按照GB/T 3543.4—1995檢測(cè)稻谷和小麥種子的發(fā)芽率。發(fā)芽試驗(yàn)采用人工氣候箱，于恒溫(稻谷30℃，小麥25℃)放置14 d，光照時(shí)間均設(shè)置為12 h光照，12 h黑暗處理，并于第14天檢測(cè)其發(fā)芽率。每個(gè)試驗(yàn)設(shè)重復(fù)3次。

1.3.3 胚乳粉制備

將儲(chǔ)藏0～24個(gè)月的稻谷和小麥種子顆粒采用人工去胚，并將去胚后的部分用小型高速粉碎機(jī)粉碎至過(guò)100目篩，制成胚乳粉樣品，與種子顆粒樣品采用相同的檢測(cè)方法檢測(cè)其超弱發(fā)光，每樣品設(shè)重復(fù)7次。每樣品自粉碎后開(kāi)始計(jì)時(shí)，統(tǒng)一在粉碎后10 min進(jìn)行超弱發(fā)光值的測(cè)定，以避免粉碎后放置時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)超弱發(fā)光值的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 貯藏時(shí)間對(duì)稻谷和小麥種子顆粒超弱發(fā)光值與發(fā)芽率的影響

0～24個(gè)月的貯藏對(duì)稻谷和小麥種子顆粒超弱發(fā)光值與發(fā)芽率的影響如圖1和圖2所示。從圖1和圖2中不難看出，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，稻谷和小麥種子的發(fā)芽率均逐漸下降。稻谷種子在兩年的貯藏時(shí)間內(nèi)，其平均發(fā)芽率從96%下降到52%。小麥種子在兩年的貯藏時(shí)間內(nèi)，其平均發(fā)芽率從93%下降到55%。這是種子貯藏過(guò)程中的呼吸作用使稻谷和小麥種子陳化導(dǎo)致的。呼吸作用是種子內(nèi)活組織在酶和氧的參與下將本身的貯藏物質(zhì)進(jìn)行一系列的氧化還原反應(yīng)，最后放出二氧化碳和水，同時(shí)釋放能量的過(guò)程，是活組織特有的生命活動(dòng)［9－11］，有研究將這一生命活動(dòng)機(jī)理性解釋為胚組織的酸敗變質(zhì)［12］。

同時(shí)，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，稻谷和小麥種子顆粒的超弱發(fā)光值也逐漸下降。由于超弱發(fā)光反映了生物體細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的新陳代謝、功能調(diào)解和信息交換，是生物體生長(zhǎng)代謝的動(dòng)態(tài)指標(biāo)，因此，稻谷和小麥種子顆粒超弱發(fā)光值的這一變化很可能是其生活力(發(fā)芽率)下降導(dǎo)致的。從圖1和圖2中，也能明顯看出稻谷和小麥種子顆粒的超弱發(fā)光值與發(fā)芽率在貯藏期間同時(shí)下降，且下降幅度(下降的斜率)也類似，均為50%左右。這與前人的研究結(jié)果類似［4－8］。

2.2 貯藏時(shí)間對(duì)稻谷和小麥胚乳粉超弱發(fā)光值的影響

現(xiàn)有研究表明，伴隨稻谷和小麥種子的貯藏，由呼吸作用導(dǎo)致的胚組織的酸敗變質(zhì)也會(huì)伴隨著一定程度的胚乳組織(主要是淀粉)的變性［13－14］，而一些大分子物質(zhì)(尤其是多糖，如淀粉)的結(jié)構(gòu)改變，也會(huì)伴隨著其超弱發(fā)光的變化，如淀粉自由基的弛豫發(fā)光［15］。因此要判定貯藏期內(nèi)稻谷和小麥種子顆粒超弱發(fā)光值與發(fā)芽率(生活力)確實(shí)存在相關(guān)性，必須首先排除胚乳組織在貯藏期內(nèi)的變化對(duì)稻谷和小麥種子顆粒超弱發(fā)光值的影響。

為此，本研究對(duì)0～24個(gè)月儲(chǔ)藏期內(nèi)稻谷和小麥種子去胚后的胚乳粉進(jìn)行了超弱發(fā)光值檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖3和圖4所示。從圖3和圖4中可以看出，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，稻谷和小麥種子的胚乳粉的超弱發(fā)光值從平均值角度來(lái)講，略有下降的趨勢(shì)，但統(tǒng)計(jì)學(xué)上并不存在顯著的差異。由此可以判定，貯藏期內(nèi)稻谷和小麥種子顆粒超弱發(fā)光值與發(fā)芽率(生活力)確實(shí)存在密切的相關(guān)性，且不受種胚以外的組織成分變化的影響。

2.3 稻谷和小麥種子顆粒超弱發(fā)光值與發(fā)芽率的關(guān)系

取圖1和圖2中的試驗(yàn)結(jié)果，建立稻谷和小麥種子顆粒超弱發(fā)光值與發(fā)芽率的關(guān)系圖形，并進(jìn)行建模，結(jié)果如圖5和圖6所示，稻谷和小麥種子顆粒超弱發(fā)光值與發(fā)芽率的關(guān)系存在明顯的差異。小麥種子顆粒的超弱發(fā)光值與發(fā)芽率呈良好的線性相關(guān)性［式(4)，R=0.998］，而稻谷種子顆粒的超弱發(fā)光值與發(fā)芽率經(jīng)線性擬合［式(3)，R=0.976］和非線性擬合［式(2)，R=0.993］發(fā)現(xiàn)，更符合非線性關(guān)系。式(2)和式(4)的R值都很高，這兩個(gè)模型可很好地通過(guò)稻谷和小麥的超弱發(fā)光值來(lái)預(yù)測(cè)其貯藏期間的發(fā)芽率，且超弱發(fā)光檢測(cè)可在10 min內(nèi)完成，這為稻谷和小麥生活力指標(biāo)(發(fā)芽率)的快速判定技術(shù)及裝備的研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

通過(guò)對(duì)圖5和圖6的進(jìn)一步分析可以發(fā)現(xiàn)，若都采用線性擬合，由式(3)和式(4)可知，稻谷的擬合直線斜率大于小麥。并且，若聯(lián)立式(2)和式(3)，可以解得兩個(gè)模型的交點(diǎn)在發(fā)芽率為62%(接近貯藏18個(gè)月的發(fā)芽率)和93%(接近收獲時(shí)的發(fā)芽率)左右處。這說(shuō)明，稻谷在62%～93%的發(fā)芽率范圍內(nèi)，在給定的發(fā)芽率下，由式(2)得到的超弱發(fā)光值較由式(3)得到的超弱發(fā)光值更低，而稻谷種子顆粒的超弱發(fā)光值與發(fā)芽率更符合式(2)這種非線性關(guān)系，這說(shuō)明稻谷在收獲后18個(gè)月的貯藏過(guò)程中，其發(fā)芽率降低所伴隨的胚組織的酸敗變質(zhì)程度(與超弱發(fā)光值負(fù)相關(guān))很可能要強(qiáng)于小麥，即稻谷在試驗(yàn)條件下的陳化速度快于小麥。

根據(jù)周惠明［14］的報(bào)道，當(dāng)?shù)竟群托←満氏嗤瑫r(shí)，在較高的溫度(20～40℃)貯藏時(shí)，稻谷陳化速度快于小麥;在較低的溫度(低于20℃)貯藏時(shí)，稻谷陳化速度慢于小麥。而本研究采用人工氣候室貯藏稻谷和小麥所設(shè)定的溫度為25℃，本試驗(yàn)結(jié)果與之相互印證。

3 結(jié)論

3.1 通過(guò)對(duì)貯藏0～24個(gè)月的稻谷和小麥種子顆粒及去種胚后的胚乳淀粉的超弱發(fā)光分析，證明了貯藏期內(nèi)稻谷和小麥種子顆粒超弱發(fā)光值與發(fā)芽率(生活力)確實(shí)存在密切的相關(guān)性，且不受種胚以外的組織成分變化的影響。

3.2 小麥種子顆粒的超弱發(fā)光值與發(fā)芽率呈良好的線性相關(guān)性，而稻谷種子顆粒的超弱發(fā)光值與發(fā)芽率更符合非線性關(guān)系，所建立的模型可以很好地通過(guò)稻谷和小麥的超弱發(fā)光值來(lái)預(yù)測(cè)其貯藏期間的發(fā)芽率。

3.3 在本試驗(yàn)的條件下，在18個(gè)月左右的貯藏期間內(nèi)，稻谷的陳化速度要快于小麥。

［1］Ramamoorthy V，Viswanathan R，Raguchander T，et al.Induction of systemic resistance by plant growth promoting rhizobacteria in crop plants against pests and diseases［J］.Crop Protection，2001，20(1):1 －11

［2］張新華，楊洪強(qiáng).植物的超微弱發(fā)光［J］.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2003，34(4):605 －608

［3］列光華，趙鵬飛，張信明，等.激光微束技術(shù)、生物超微弱發(fā)光與生物生命奧秘［J］.青海師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2003(1):78－81

［4］張仲倫.微弱發(fā)光分析技術(shù)應(yīng)用實(shí)例(四)［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2000，27(1):102－104

［5］鮑杰，吳才章.基于虛擬儀器的小麥新陳度檢測(cè)［J］.中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2011，26(6):102 －105

［6］楊起簡(jiǎn)，周禾.鹽脅迫下豌豆幼苗的超弱發(fā)光［J］.激光生物學(xué)報(bào)，2001，10(4):265 －268

［7］吳文福，夏艷輝，周德義，等.干燥后玉米種子生物超弱發(fā)光與活力相關(guān)性的研究［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2002，18(3):8－10

［8］張菊平，張興志，鞏振輝.超微弱發(fā)光在蔬菜研究中的應(yīng)用［J］.園藝園林科學(xué)，2006，22(1):220 －222

［9］Chen W L，Xing D，Wang J.Rapid determination of rice seed vigour by spontaneous chemiluminescence and singlet oxygen generation during early imbibition［J］.Luminescence，2003，18(1):19－24

［10］顧振新，陳志剛，汪志君，等.糙米與稻谷的發(fā)芽活力及發(fā)芽期間主要物質(zhì)含量比較［J］.中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2004，19(2):8－10

［11］于勇，廖文艷，王俊.輻照稻谷種子的種胚微觀結(jié)構(gòu)特性及其萌發(fā)特性研究［J］.中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2009，24(3):1－6

［12］徐斌，李波，苗文娟，等.小麥胚芽貯藏過(guò)程中的酸敗變質(zhì)機(jī)理［J］.中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2011，26(9):123－128

［13］楊春，丁衛(wèi)英，周柏玲，等.發(fā)芽對(duì)黑小麥、黑苦蕎淀粉物理化學(xué)特性的影響［J］.中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2011，26(12):5－10

［14］周惠明.谷物科學(xué)原理［M］.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，2003:149－194

［15］顧恩東，朱拓，史愛(ài)敏，等.淀粉自由基弛豫發(fā)光［J］.光子學(xué)報(bào)，2008，28(8):1579 －1583.