黏紅酵母產油脂培養基的響應面優化

李市場 張鵬鵬 楊 娜 張 晶 王永杰

(河南科技大學食品與生物工程學院，洛陽 471003)

微生物油脂是微生物以碳水化合物、碳氫化合物和普通油脂為碳、氮源，輔以無機鹽生產的一種商業價值較高的油脂［1］。隨著世界人口的不斷增多，動植物油脂的生產已無法滿足市場需求，所以開發利用微生物進行油脂的工業化生產成為一大研究熱點。

微生物油脂具有生長周期短，不受氣候季節變化影響，不占用耕地等的優點，但是微生物油脂也有其局限性，最明顯的一點就是微生物細胞通常含油量低，僅含2% ～3%的油脂，無法滿足工業化生產的要求，但是在特定條件下某些微生物干菌體含油率可達80% ～90%，油脂產量可達15 g/L左右，這使微生物油脂的工業化生產成為可能［2］。目前國內外主要通過菌種篩選及誘變和優化發酵條件等手段來提高油脂產量［3］。為了提高微生物油脂產量，將單因素試驗和響應面分析法(RSM)用于黏紅酵母菌體的發酵培養基的優化，以油脂含量為響應值，采用多元二次回歸擬合出方程，得培養基各營養物質的最佳配比。

1 材料與方法

1.1 菌種

黏紅酵母(Rhodotorula glutinis)D30:中國工業微生物菌種保藏中心(CICC)的黏紅酵母31596誘變所得的高產菌株［4］。

1.2 培養基

斜面培養基:加入2%瓊脂和2%蛋白胨的10%麥芽汁，pH:5.8，115 ℃，滅菌30 min。

種子培養基:加入2%蛋白胨的10%麥芽汁，pH:5.8，115 ℃，滅菌 30 min。

發酵培養基(g/L):葡萄糖:80;蛋白胨:1.8;KH2PO4:2.5;pH:5.8，115 ℃，滅菌 30 min。

1.3 培養工藝

斜面培養:轉接斜面后置于28℃的恒溫培養箱中，培養48 h，4℃保藏;

種子培養:從斜面刮取3環菌體，接種于種子培養基中(250 mL三角燒瓶裝液30 mL)，28℃搖床轉速為190 r/min培養20 h。

發酵培養:按9%的接種量接種于發酵培養基中(裝液量為250 mL三角瓶裝液30 mL)，28℃搖床轉速為190 r/min培養96 h。

1.4 油脂提取

由于黏紅酵母所產生的油脂屬于胞內物質，要提取出油脂必須要對細胞進行破碎［5－6］。向離心收集好的菌體加入10 mL 4 mol/L鹽酸，振蕩混勻，室溫放置30 min后，沸水浴5 min，－20℃速冷10 min;然后使用超聲波細胞破碎儀進一步破碎細胞，超聲功率200 W，全程時間5 min，超聲時間3 s，間歇時間4 s。

加入2倍體積氯仿∶甲醇(2∶1)提取液，充分振蕩，4 000 r/min離心25 min，取氯仿層，加等體積0.1%氯化鈉溶液，混勻，4 000 r/min離心25 min，取氯仿層，揮發除去氯仿即得油脂［7－8］。

1.5 氣相分析油脂組成

1.5.1 樣品的處理

取適量油脂樣品置于10 mL具塞刻度試管中，加入石油醚－無水乙醚(4∶3)的混合溶劑5 mL，振蕩溶解，再加入0.5 mol/L溶液4 mL振蕩1 min，靜置10～15 min后加入1 mL蒸餾水，靜置分層，取上清液進樣［9］。

1.5.2 氣相色譜條件

選用美國安捷倫6890N氣相色譜儀，采用DBWAX(30 m ×0.25 mm ×0.25 μm)毛細管石英柱;FID檢測器;載氣為高純氮氣;恒流模式，流速1 mL/min，尾吹氣流量:30 mL/min;H2流速:40 mL/min，空氣流速:400 mL/min，進樣量:1 μL，分流比:1∶100;進樣口溫度:250℃:檢測器溫度:270℃柱溫采用三級程序升溫:初溫90℃，以7℃/min升溫至190℃，再以3℃/min升溫至215℃保持10 min，再以20℃/min升溫至230℃，保持5 min。

2 結果與分析

2.1 單因素優化試驗

2.1.1 碳源對黏紅酵母D30油脂產量的影響

選用葡萄糖 20、40、60、80、100 g/L 5 個梯度進行研究，發現在加入量在20～80 g/L之間時，油脂的產量隨著葡萄糖的增加而增加，到80 g/L時候達到最大值，此時油脂的產量為2.73 g/L。當葡萄糖的加入量大于80 g/L時，油脂的產量反而減少。這說明葡萄糖加入量過高過低都不利于菌體生長和產油脂。若加入過低，培養基中沒有足夠的碳源供菌體生長;加入量過高，可能導致培養基中產生較高的糖濃度，從而抑制菌體的生長和油脂的合成。所以80 g/L即為菌體產脂的最佳碳源加入量。

圖1 碳源加入量對油脂產量的影響圖

2.1.2 氮源對黏紅酵母D30油脂產量的影響

由圖2蛋白胨與油脂產量的影響關系可知:蛋白胨作為微生物生長的氮源，當氮源的加入量為1.2～1.5 g/L隨蛋白胨的增大油脂產量略微上升，當大于1.5 g/L時油脂產量急劇下降，這是因為氮源促進黏紅酵母的生長繁殖，生物量隨氮源的增加而增多，但是過量的氮源又不利于菌體中油脂的積累。因此，初步確定蛋白胨的添加量為1.5 g/L。

圖2 氮源加入量對油脂產量的影響

2.1.3 無機鹽對黏紅酵母D30油脂產量的影響

由圖3可以看出，當KH2PO4的加入量在2.0～3.0 g/L之間時，隨著KH2PO4的加入量的增大，油脂的積累逐漸的增加，在3.0 g/L時達到最大值。當加入量大于3.0 g/L時，油脂的產量卻開始下降，所以，KH2PO4的加入量選用3.0 g/L作為最優的加入量。

圖3 KH2PO4對油脂產量的影響

由以上單因素試驗，初步得出培養基的配方為(g/L):葡萄糖:80，蛋白胨:1.5，KH2PO4∶3。

由于單因素試驗是在固定其他成分不變的情況下，只選取一個變量進行研究，沒有考慮到各成分間的交互作用。所以，為了考察各成分間的交互作用，需要利用響應面設計對培養基進行進一步的優化。

2.2 響應面優化黏紅酵母發酵培養基

2.2.1 響應面分析因素水平的選取

利用Box－Behnken試驗設計［10］對培養基的3種成分葡糖糖、蛋白胨、KH2PO43個顯著因素進行優化試驗。以葡糖糖(X1)、蛋白胨(X2)、KH2PO4(X3)為變量，每個變量按低、中、高3個水平分別以－1、0、+1進行編碼，其中高低值分別為中間值得正負1.5倍。試驗因素及水平見表1。

表1 響應面分析因素和水平

2.2.2 響應面法分析結果

根據表1的因素和水平，以X1、X2、X3為自變量，以最后所得油脂重量為響應值(Y)，試驗方案及結果見表2。

表2 響應面分析試驗方案及結果

以油脂產量為響應值。根據表2中Box—Behnken設計的試驗結果。運用SAS軟件［11］對表2的結果進行二次回歸分析。得到二次回歸方程(predictive model for Y)如下:

從方差分析表3可以看出模型在α=0.01水平上回歸顯著，失擬項反映的是試驗數據與模型不相符的情況，P=0.753 157 ＞0.1，失擬不顯著，因此模型選擇正確［12］。同時，一次項、平方項、交叉項均對響應值有顯著性影響。從表3可模擬分析可信度，通過模擬分析可知，其中復相關系數的平方R2=99.67%說明模型可以解釋99.67%試驗所得油脂產量的變化。表明方程擬合較好。

表3 回歸方程的方差分析

2.2.3 響應面圖及等高線

因子的交互作用效應可以從響應曲面的坡度變化及等高線的形狀得到反映，響應曲面坡度的平緩與陡峭程度，表明在培養基配比變化時黏紅酵母產油量的響應靈敏程度［13－14］。如果響應曲面坡度相對平緩，響應值不敏感;反之，如果響應曲面坡度非常陡峭，表明響應值非常敏感，等高線的形狀為橢圓形表示因素交互作用顯著。為圓形則表示因素交互作用可忽略。

圖4 Y=f(X1，X2)的響應面與等值線

圖4～圖6直觀地反映了各因素對響應值的影響，由等值線圖可以看出存在極值的條件應該在圓心處［15］。比較3組圖可知:葡萄糖(X1)對油脂產量的影響較為顯著，表現為曲線較陡，而KH2PO4(X3)、蛋白胨(X2)次之，表現為曲線較為平滑，且隨其數值的增加，響應值變化較小。

可得出 X1、X2、X3存在極值點，Y1的最大估計值為3.49 g/L，對應的因素濃度為葡萄糖73.40 g/L，蛋白胨1.06 g/L，磷酸二氫鉀3.56 g/L。

2.2.4 驗證試驗

根據響應面分析得到發酵培養基最佳工藝參數為:葡萄糖 73.40 g/L，蛋白胨 1.06 g/L，磷酸二氫鉀3.56 g/L。在此條件下，油脂產量的理論預測值可達到 3.49 g/L。

為了驗證響應面分析的可靠性，采用上述最佳工藝參數進行驗證試驗，用誘變后的高產菌株D30進行驗證試驗，經過3次平行。

表4 優化條件下的驗證試驗

3 油脂脂肪酸組成

將提取得到的油脂甲酯化后進行氣相色譜分析，其結果如表5

表5 脂肪酸組成及含量

結果顯示，黏紅酵母油脂中C16～C18的脂肪酸質量分數約為97.83%，且多不飽和脂肪酸的質量分數高達26.97%。

4 高產突變株D30的發酵動力學分析

把菌株D30接入發酵培養基進行搖瓶培養，每隔24 h取樣檢測其各項發酵參數如生物量、油脂產量和殘糖等，結果見圖7。

從D30的發酵曲線可以看出，油脂產量和生物量的增長曲線基本一致，發酵培養2 d后進入快速增長期，油脂產量隨著生物量的增加而增加，同時殘糖量快速減少。發酵培養6 d后進入穩定生長期，油脂開始大量積累。在10 d時，生物量和油脂產量達到最大值，分別為47.98 g/L(菌體濕重)和 7.81 g/L，此時為發酵終點。達到發酵終點以后，生物量和油脂產量均開始下降，可能是因為葡萄糖將消耗盡，菌體自溶，油脂被當做碳源被菌體利用。

圖7 D30的發酵曲線

5 結論

采用Box—Behnken設計和SAS軟件分析確定出主要因素的最適濃度，得到最適發酵培養基(g/L)為:葡萄糖 73.40、蛋白胨 1.06、磷酸二氫鉀 3.56，通過驗證試驗測得最適培養基發酵生成的油脂為3.49 g/L，比初始條件下油脂的產量提高了13%。經氣相色譜分析，其多不飽和脂肪酸的質量分數高達26.97%。然后又對高產菌株的發酵特性進行研究，在10 d時，菌體量和油脂產量達到最高，糖濃度已經降到最低，此時達到發酵終點，生物量為47.98 g/L(菌體濕重)，油脂產量達到7.81 g/L，具有較高的研究和應用價值。

回歸方程所得到的最佳預測值與驗證值非常接近，說明響應面分析法提供的模型較真實的擬合了實際情況，因此用響應面法優化油脂培養基是有效可行的。

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