水酶法提取橡膠籽油的工藝研究

祖亭月 何美瑩 張連富

(江南大學食品學院1，無錫 214122)

(云南省熱帶作物科學研究所2，景洪 666100)

橡膠籽(Rubber seed)是橡膠種植業的副產品，種仁含油率高達50%，且橡膠籽油中不飽和脂肪酸含量很高，因此橡膠籽是一種優質的油料資源。我國現有橡膠種植面積約49.3萬 hm2，主要分布在海南和云南兩省。據估計，我國橡膠籽年產量可達80萬噸，預計可生產橡膠籽油35萬噸［1］。橡膠籽油有著悠久的食用歷史，我國對橡膠籽油的利用始于20世紀50年代后期，當時國內生活資料十分匱乏，食用油更是短缺。植膠農場就開始了用橡膠子油作為食用油的利用實踐。與此同時，華南熱帶作物研究院、云南省熱帶作物科學研究所、昆明醫學院、海南醫學院等科研院所也加快了對橡膠種子油的成分、安全性、功能性等方面的研究，取得了60余項成果(含論文成果)。研究結果表明，精煉的橡膠籽油不但可以食用，還可以降低血脂膽固醇，對治療和預防動脈硬化及心血管系統疾病有明顯的療效［2－3］。

水酶法提油工藝是一種新興的提油方法，它通過機械和酶解來降解植物的細胞壁，使細胞中的油脂釋放出來［4］。水酶法提油與傳統工藝相比，有如下優點:能夠保證較高的游離油得率，得到無有機溶劑殘留的可以直接食用的油;處理條件溫和，所提取的油純度高，色澤淺，酸值及過氧化值低;蛋白質變性程度小，有利于殘渣中蛋白質的綜合利用;與溶劑浸提法相比，水酶法提油所產生的廢水BOD和COD下降30% ～40%，有利于環境保護和油脂工業的可持續發展［5］。目前，水酶法已廣泛應用于芝麻油、大豆油、玉米胚芽油、花生油等的提取［6－9］，但是未見在橡膠籽油提取方面的利用。鑒于橡膠籽油的高產量，研究水酶法在橡膠籽油提取方面的應用是很有價值的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

橡膠種子:云南熱帶作物研究所提供;檸檬酸、磷酸氫二鈉(分析純):國藥集團化學試劑公司;果膠酶、水解蛋白酶、多聚半乳糖醛酸酶、纖維素酶、中性蛋白酶、復合植物水解酶、β－葡聚糖酶:諾維信公司;山梨醇單月桂酸酯(司盤－20)、聚氧乙烯山梨糖醇酐單硬脂酸酯(吐溫－60)(分析純):國藥集團化學試劑公司。

1.2 儀器與設備

SXJQ－1型數顯直流無極調速攪拌器:鄭州長城科工貿有限公司;控溫水浴鍋:江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;DELTA 320 pH計:梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司;EBA20離心機:德國Hettich公司;600克搖擺式高速中藥粉碎機:溫嶺市林大機械有限公司;GC－2010氣象色譜儀:日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 橡膠籽基本成分的測定

水分測定:GB/T 5009.3—2003直接干燥法;粗蛋白測定:GB/T 5009.5—2003凱式定氮法;粗脂肪測定:GB/T 5512—2008索氏提取法;粗纖維含量的測定:GB/T 5009.10—2003酸性洗滌法;灰分含量的測定:GB/T 2009.4—2003重量法;氰化物測定:GB/T 5009.36—2003糧食衛生標準的分析方法。

1.3.2 橡膠籽油提取工藝流程和提取率計算公式

式中:A為游離油Ⅰ的質量/g;B為橡膠籽的質量/g;ω為橡膠籽中油的質量分數/%;C為游離油Ⅱ的質量/g。

1.3.3 橡膠籽的破碎

采用中藥粉碎機在25 000 r/min的轉速下對橡膠籽進行破碎，每次破碎時間為4 s，分別破碎1～5次，得到不同粒徑分布的橡膠籽粉末。根據游離油Ⅰ得率和總游離油得率考察不同粒徑對游離油得率的影響。

1.3.4 酶制劑與酶解工藝參數的研究

取50 g破碎后的橡膠籽，依照1.3.2工藝，加入原料4倍的緩沖液，調節適宜的pH和溫度，加入料液總質量0.5%的酶，酶解反應4 h，80℃滅酶10 min，5 000 r/min離心30 min，分別計算游離油Ⅰ得率和總游離油得率，根據提取率篩選出最佳酶制劑。由于使用單一酶的酶解效果往往較差，因此考慮將兩種酶復配使用，以提高清油的得率，方法同上，篩選出最佳組合。

在確定復合酶的種類后，研究固液比、酶解pH、酶解溫度、酶解時間、酶的添加量對清油提取率和總油提取率的影響，分析不同條件對橡膠籽油水酶法提油的影響，試驗重復1次。最后做4因素3水平正交試驗，確定最佳的酶解工藝參數。

1.3.5 破乳方法

將乳狀液在沸水浴中加熱10 min，用離心機在6 000 r/min下離心15 min，得到破乳油，即游離油Ⅱ。

1.3.6 橡膠籽油的質量評定

1.3.6.1 油脂脂肪酸組成的分析

將壓榨法和水酶法提取出的橡膠籽油經甲酯化后用島津GC－2010色譜儀分析。

檢測器:氫火焰離子化檢測器;分析柱:PEG－20M交聯石英毛細管柱20 m×0.25 mm;柱溫:200℃;載氣:N2。

1.3.6.2 油脂常規指標的測定

透明度、氣味、滋味檢驗:GB/T 5525—2008;色澤檢驗:GB/T 22460—2008;水分及揮發物檢驗:GB/T 5528—1995;不溶性雜質檢驗:GB/T 15688—2008;酸值檢驗:GB/T 5530—1998;過氧化值檢驗:GB/T 5538—2005;氰化物檢驗:GB/T 5009.36—2003糧食衛生標準的分析方法。

2 結果與分析

2.1 橡膠種子成分分析

測得的脫殼橡膠籽主要成分及組成見表1。

表1 橡膠籽主要成分及組成

由表1可知，橡膠籽的粗脂肪和粗蛋白含量都很高，具有很高的利用價值。水分含量各文獻報道不一［10］，與貯藏時間和干燥程度有關。

2.2 破碎次數對得率的影響

將原料進行適當的破碎，有助于細胞中油滴的釋放［11］，增加游離油得率。從圖1可以較直觀的看出，破碎程度較高的細胞，油脂釋放較容易。根據文獻報道［12］，破碎有干法破碎和濕法破碎，但是由于濕法破碎容易產生乳狀液，降低提取率，故本試驗只采用干法破碎。不同破碎次數下游離油Ⅰ和總游離油得率的結果見圖2。

圖1 不同破碎程度對油脂釋放的影響

圖2 不同破碎次數對游離油得率的影響

從圖2可以看出，隨著粒徑的減小，游離油得率增大。但是在粒徑較大時，形成的乳狀液較少，隨著粒徑的減小，形成的乳狀液增多，這是因為溶出了更多的蛋白質，與油發生了乳化。因此選擇破碎3次得到的橡膠籽粉末進行后續試驗。

2.3 酶制劑對得率的影響

2.3.1 單一酶制劑對得率的影響

水酶法是用酶水解油料細胞的細胞壁、脂蛋白或脂多糖，使其中包裹的油釋放出來，以提高得油率。橡膠籽仁細胞壁的主要成分是纖維素、半纖維素和果膠質，故選取可以水解這些物質的酶進行試驗。本試驗主要選取了果膠酶、水解蛋白酶、多聚半乳糖醛酸酶、纖維素酶、中性蛋白酶、復合植物水解酶、β－葡聚糖酶，用以上酶分別處理后，以游離油Ⅰ提取率為指標對不同酶制劑的作用效果進行比較，結果見圖3。

圖3 單一酶制劑對游離油得率的影響

由圖3可以看出，在無酶的條件下，游離油Ⅰ得率僅為22.6%，總游離油得率也僅為25.8%。單獨使用其他酶，得率有所提高，但是總體水平不高。這是因為每一種酶有其酶解的專一性，單獨使用效果有限，故考慮將酶復配使用，以提高提油率。

2.3.2 復配酶制劑對得率的影響

將兩種不同的酶復配后進行酶解，以得率為指標，對酶解效果進行比較，結果見圖4。

圖4 復配酶制劑對游離油得率的影響

由圖4可以看出，將酶制劑復配可以顯著提高得率。這是因為細胞壁的組成成分主要是纖維素和多糖類物質，若只用單一酶處理很難將其分解完全。其中，酶組合5得油率最高，且乳狀液形成量較少，故選取這一組合為復配酶制劑組合。

試驗還嘗試了將3種酶復配進行比較，但是得油率未有明顯提高，考慮到生產成本，故選用纖維素酶與β－葡聚糖酶作為復合酶制劑。

2.4 酶解條件對得率的影響

2.4.1 固液比對游離油得率的影響

固定反應條件為pH 4.5，酶解溫度50℃，酶解時間4 h，加酶量為0.5%(每種酶單獨的添加量)，研究不同固液比對游離油得率的影響，結果見圖5。

圖5 固液比對游離油得率的影響

由圖5可以看出，開始時隨液體比例的增加，游離油的得率也隨之增加，至1∶4時達到最大值，隨后液體再增加，油得率逐漸降低。固液比較低時，乳狀液形成量較少，隨著固液比增大，由于蛋白質溶出量增多，乳狀液的量也增大。故選取固液比為1∶4，此時游離油得率較高，且乳狀液生成量適中。

2.4.2 pH對游離油得率的影響

pH影響著酶的活性，也影響著蛋白質的溶解度。為得到較多的澄清油，盡量防止乳化的發生，有必要對不同pH的作用效果進行比較，結果見圖4。其他酶解條件為溫度50℃，固液比1∶4，酶解時間4 h，酶添加量為 0.5%。

圖6 不同pH對游離油得率的影響

由圖6可以看出，pH較低時游離油得率較低，隨著pH的升高，游離油得率隨之升高，至pH 5.0時達到最大，游離油得率為72.3%。還可以看出，在較低pH時，乳狀液生成量較低，隨pH升高，乳狀液的生成量也升高，從而導致游離油得率降低。因為pH影響著蛋白質的等電點，在pH較高時，有較多的蛋白質溶解在油中，起到了表面活性劑的作用，導致較多的乳狀液形成。從圖6可以看出，在pH 5.0時，游離油得率最高，且乳狀液生成量較低，故選取pH 5.0為最佳反應pH。

2.4.3 酶解溫度對游離油得率的影響

酶解溫度對于酶的活性影響很大，通常溫度高時酶活性較大。纖維素酶與β－葡聚糖酶的最適溫度為40～60℃。不同溫度下酶解效果見圖5。其他條件為:固液比1∶4，pH 5.0，酶解時間4 h，酶添加量為0.5%。

圖7 溫度對游離油得率的影響

由圖7可以看出，游離油得率隨溫度升高而增大，50℃時達最大，得率為73.5%。之后溫度繼續升高，游離油得率下降加速，原因是溫度過高，加速了酶的失活，從而減弱了酶解作用，導致游離油得率下降。乳狀液的生成隨溫度升高而降低，這是因為高溫降低了乳狀液的穩定性，有助于破乳。但為了得到較高的游離油得率，選取最適酶解溫度為50℃。

2.4.4 酶解時間對游離油得率的影響

酶與底物接觸的時間越長，酶解得越徹底，故研究酶解時間對游離油得率的影響。其他反應條件為:固液比 1∶4，pH 5.0，溫度 50 ℃，酶添加量為0.5%。結果見圖 8。

圖8 酶解時間對游離油得率的影響

由圖8可以看出，隨著酶解時間的延長，提油率緩慢增長，但是超過12 h后，游離油得率都開始下降，原因可能是油與蛋白質接觸時間過長，產生了穩定的乳狀液，破乳也比較困難。還可以看出，在酶解時間為8、10、12 h時，游離油得率幾乎沒有變化，考慮到生產成本，選擇酶解時間為8 h較適合。

2.4.5 酶添加量對游離油得率的影響

選取不同的酶添加量，考察其對游離油得率的影響。其他反應條件為:固液比1∶4，反應時間4 h，反應溫度50℃，pH 5.0。結果見圖9。

圖9 不同酶添加量對游離油得率的影響

由圖9可以看出，游離油得率隨酶添加量的增加而略有增加，當酶添加量增加到0.7%時，游離油得率反而降低。這可能是由于隨著酶添加量的增加，油釋放的速度加快，乳狀液形成速度隨之增加，導致游離油得率降低。同時，酶添加量增加，容易形成穩定的乳狀液，導致破乳困難，使總游離油得率也略有下降。

2.4.6 酶解工藝的優化

選取固液比，酶解時間，酶添加量，酶解溫度進行四因素三水平正交試驗，按L9(34)設計正交表，以總游離油得率為指標，正交試驗的因素水平見表2。

表2 正交試驗因素水平表

按照L9(34)設計，以總游離油得率為指標進行正交試驗，結果見表3。

表3 正交試驗結果表

對上述結果進行方差分析，結果見表4。

表4 方差分析表

極差分析和方差分析結果表明，影響總游離油得率因素的順序為酶解時間＞酶解溫度＞酶添加量＞固液比，其中，酶解時間對結果影響顯著，最佳反應組合為A1B2C3D2。但是組合A1B2C2D2與最佳組合相比，相差不大，但是反應條件比最佳組合低，考慮到生產成本，故選取組合A1B2C2D2代替最佳組合。即酶解工藝確定為固液比1∶4，酶解時間8 h，酶添加量0.5%，酶解溫度50℃。

3 橡膠籽油質量評定

3.1 橡膠籽油的脂肪酸組成

將水酶法提取的橡膠籽油處理后，測定其脂肪酸組成，結果見圖10a。同樣方法分析壓榨橡膠籽油的脂肪酸組成，結果見圖10b。

圖10 不同方法提取的橡膠籽油的脂肪酸氣相色譜圖

將圖10的峰經歸一化處理后得到的橡膠籽油主要脂肪酸組成見表5。可以看出，橡膠籽油不飽和脂肪酸質量分數很高，達到了84.5%，因此橡膠籽油是一種具有很好的保健作用的新的食用油。水酶法提取油與壓榨法提取油的脂肪酸組成無明顯差別，說明水酶法工藝對于油的品質沒有破壞，進一步說明了水酶法提取橡膠籽油工藝是可行的。

表5 橡膠籽油的主要脂肪酸組成

3.2 橡膠籽油的理化指標

由于橡膠籽油是一種新型食用油，目前還沒有國標來評定其等級。將橡膠籽與幾種常見的油料原料進行比較，橡膠籽與葵花籽組成最為接近，故選用葵花籽油的國家標準作為橡膠籽油質量評定的依據，結果見表6。

表6 橡膠籽油質量評定

將水酶法和壓榨法得到的橡膠籽油分別進行了氰化物的定性檢測，水酶法提取的橡膠籽油未檢出氰化物，但是壓榨法提取的橡膠籽油檢出了氰化物。因此，采用水酶法提取的橡膠籽油無需進一步進行氰化物的脫除，從而簡化了制取工藝。

由表6可以看出，用水酶法得到的橡膠籽油除酸值偏高外，其余均符合國家標準。酸值偏高的原因一方面是因為原料貯存較久，另一方面是因為水酶法提取工藝是在較低的pH下進行的，pH約為5.0，導致游離油的酸值偏高。而且，H+可以作為油脂水解的催化劑，促使油脂發生水解反應，游離脂肪酸增加，酸值也會隨之增高。

水酶法提取的橡膠籽油，只需進行脫酸得到符合標準的成品油，比起壓榨法提取工藝需要脫膠、脫酸、脫臘、脫水、脫臭、脫色等精煉步驟而簡化了許多，從而使生產效率得到了提高，并且減少了污染。

4 結論

本試驗通過單因素和正交試驗優化了工藝參數，確定了水酶法的最佳提取工藝為固液比1∶4，酶解時間8 h，酶添加量0.5%，酶解溫度50℃，pH 5.0。在5 000 r/min下離心 30 min，然后對乳狀液進行加熱破乳，破乳條件為沸水浴10 min，6 000 r/min下離心10 min。最后總游離油得率可達到89.3%。

采用水酶法提取的橡膠籽油，品質較好，后續所需精煉步驟簡單，節約了精煉步驟所需的成本。提取率高于壓榨法的提取率(約66%)，并且，水酶法的反應條件溫和，蛋白質變性小，可對殘渣中的蛋白質進行回收，有利于原料的綜合利用。

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