人表皮活性因子柔性納米脂質體的制備及相關性質研究

唐 冰 ，唐寧寧

(1.中國人民解放軍成都軍區昆明總醫院藥劑科，云南 昆明 650032;2.中國人民解放軍77200部隊，云南 昆明 650032)

表皮活性因子(EGF)是相對分子質量為6 216的活性多肽，由53個氨基酸組成，是人體重要的活性蛋白多肽物質之一，可促進受損表皮的修復與再生，對燒傷、燙傷、光療等多種表皮創傷的修復功效十分顯著，同時還可修復腸胃道、肝臟和眼角膜的損傷等。但EGF在局部使用過程中，很容易降解失活，極大地影響了其療效，故需要采用適當的劑型提高其穩定性。柔性納米脂質體，又稱傳遞體(transfersomes)，它是在普通脂質體中加入表面活性成分，使脂質體具有柔韌性和變形性，不僅能提高所包載活性成分的穩定性，還能通過水合作用，提高活性成分的透皮吸收效果。利用柔性納米脂質體制備技術對EGF進行改造，可以提高EGF的穩定性，促進EGF的吸收，延長EGF的釋放作用時間，從而更好地發揮EGF的治療作用。

1 儀器與材料

Avestin EF－C5型高壓均質擠出機(加拿大);RE－5220型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠);JY92－Ⅱ型超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司);Malvern Zetasizer nano ZS90型電位粒徑測試儀(英國);JEM－1010型透射電鏡(日本)，Thermo LL3000型冷凍干燥機(德國);Biotek酶標儀(美國)。氫化大豆磷脂(日本日油株式會社，純度98%);膽固醇(天津市大茂化學試劑廠);去氧膽酸鈉(天津市大茂化學試劑廠);甘露醇(上海實驗試劑有限公司);維生素E(Sigma);氯仿(無錫市展望化工試劑有限公司);EGF(上海華源生命科學研究開發有限公司，規格為1×106IU/mg);EGF酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(Bluegene公司，貨號為 E01E0216，靈敏度為 1.0 ng/mL);TritonX －100(北京鼎國生物技術有限責任公司，Lot87700150，＞99%);水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 制備(逆相蒸發法)[1]

精密稱取大豆磷脂、膽固醇和維生素E，置梨形瓶中，加入適量氯仿(含1%無水乙醇)，于4℃水浴中溶解脂質。取甘露醇、膽酸鈉和EGF溶解于4℃ PBS(pH=7.4)溶液中。脂質溶解后，將PBS溶液倒入脂質溶液中，在水浴式超聲儀中(低于10℃)超聲10min(超聲10 s，停5 s)，形成均勻乳液。室溫下放置30min。將乳液于旋轉蒸發儀上減壓蒸發(負壓0.07 MPa，轉速500 r/min)，形成水相脂質體混懸液后，繼續蒸發15min，以徹底去除有機溶劑。再在水浴式超聲儀中(低于10℃)超聲10min(超聲10 s，停5 s)。將脂質體混懸液轉移高壓均質擠出機中，高壓均質3次，再通過0.1μm微孔濾膜擠出10次后，－40℃預凍24 h后，于冷凍干燥機中制備成凍干粉末。

2.2 EGF含量檢測[酶聯免疫吸附法(ELISA)]

分別配制質量濃度為 15，30，50，100，200，300，400，500 ng/mL的EGF系列溶液，以0.2%TritonX－100破壞脂質膜的空白柔性納米脂質體做空白對照，按照EGFELISA檢測試劑盒說明書的方法和步驟檢測樣品，以樣品中EGF的質量濃度(X)為橫坐標、檢測的OD值(Y)為縱坐標，采用四參數回歸方法進行運算，得回歸方程 Y=(A－D)/[1+(X/C)^B]+D，以檢測樣品中EGF的含量。

2.3 脂質體分離

采用由Fry等[2]提出的Sephadex G－50微柱離心法分離柔性納米脂質體和游離EGF。將Sephadex G－50用適量PBS溶液浸泡24 h后裝柱，以3 000 r/min離心3min以去除其中多余的PBS，先用不含EGF的空白柔性納米脂質體0.25mL過柱，然后向柱中加入0.25 mL EGF柔性納米脂質體混懸液，離心，收集離心液，脂質體就和仍然滯留于柱中的游離藥物分離。

2.4 相關性質研究

柔性納米脂質體徑1.0%磷鎢酸負染，于透射電鏡下觀察其形態;將柔性納米脂質體用PBS緩沖液稀釋10倍，在室溫下用粒徑和電位分析儀測定其粒徑和電位;包封率(EE)采用以下公式計算:EE(%)=柔性納米脂質體EGF含量/柔性納米脂質體混懸液中EGF總含量×100%;載藥量:取EGF凍干脂質體1mg，置5 mL容量瓶中，加入0.2 mL 10%TritonX－100，加PBS至刻度，測定總EGF量;凍干脂質體載藥量=EGF的量/1mg×100%。本方法所制備的EGF柔性納米脂質體為多室脂質體，見圖1。其平均粒徑為(81.62±3.67)nm，Zeta電位為(60.12±7.58)mV，平均包封率為(37.86 ±4.77)%，平均載藥量為(6.58 ±1.27)%。

圖1 EGF柔性納米脂質體透射電鏡圖

2.5 變形性考察

取1mL一次性注射器，分別加入1mL蒸餾水、EGF柔性納米脂質體及 EGF 普通脂質體，分別外加 0.1，0.2，0.3，0.4 和 0.5MPa壓力，計算樣品完全通過100 nm一次性微孔濾膜的時間，計算樣品通過時間與蒸餾水通過時間之比，以考察柔性納米脂質體的變形性。結果見表1。經 t檢驗，P＜0.01，表明與普通EGF脂質體相比，EGF柔性納米脂質體具有極顯著的變形性。

表1 EGF柔性納米脂質體變形性試驗結果

2.6 穩定性考察

取3批EGF脂質體混懸液、EGF凍干粉及EGF脂質體凍干粉，分別置室溫、4℃條件下，于0，3 m測定其包封率、載藥量、pH、粒徑和Zeta電位，并觀察外觀，以確定其穩定性。結果見表2。

表2 樣品放置3個月后穩定性結果(n=3)

3 討論

采用逆相蒸發法制備水溶性成分脂質體具有較高的包封率，在旋轉蒸發過程中，應注意控制真空負壓，以防止影響脂質體形成和包封率的泡沫產生。EGF對熱穩定性較差，整個制備操作應在較低溫度下進行(4℃)，同時，如同其他脂質體一樣，在制備過程中應嚴格控制磷脂氧化產物的生成(如加入適量的維生素E)，以防產生溶血反應[3]。

在運用柱層析進行TF的分離時，由于在Sephadex G－50表面存在著能與脂質體膜結合并相互作用的微小部位。雖然這種作用并不影響脂質體在凝膠柱上的流動特征，但仍可導致少量脂質體的損失，使膜的不穩定性增加，從而導致膜滲透性的改變及包裹物質的滲漏，故需用空白脂質體預先將柱子飽和來解決[4]。但也需注意上柱量不宜太大，否則會產生TF拖尾現象。

在穩定性預試驗過程中發現，EGF溶液無論是在室溫還是在4℃條件下，其穩定性極差，12 h失活率超過80%。因此，穩定性試驗選擇脂質體混懸液、脂質體凍干粉和EGF凍干粉。結果顯示，將EGF制備成脂質體或凍干粉末，都可提高其穩定性，但在室溫條件下放置3個月，EGF脂質體混懸液或凍干粉的包封率或載藥量降低40%以上，而EGF脂質體凍干粉可顯著提高其穩定性。

由變形性試驗結果可知，柔性納米脂質體較普通脂質體具有顯著的可變形性，且其隨外力增加而增加，其表現出的良好變形性及對所包裹活性成分穩定性的提高，是其作為藥物透皮給藥載體的基礎，因此柔性納米脂質體可能成為透皮轉運的有效載體。

[1]Taylor G，Kellaway IW，Steven J.Drug entrapmentand release from multilamellar and reverse phase evaporation liposomes[J].Int JPharm，1990，58(1):49－55.

[2]Fry DW，White JC，Goldman ID.Rapid separation of low molecular weight solutes from liposomes without dilution[J].Anal Biochem，1978，90(2):809－815.

[3]翁幗英，陳明非.脂質體中卵磷脂的氧化產物與溶血的關系[J].生物化學與生物物理進展，1990，17(1):76.

[4]平其能.現代藥劑學[M].北京:中國醫藥科技出版社，1998:607.