太行山區(qū)柴胡中總皂苷及柴胡皂苷a、d 的含量測(cè)定

李 競(jìng) 高 英 李海龍 李衛(wèi)民 周海平 孔增科

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006；2.河北省邯鄲市衛(wèi)生局，河北邯鄲 056000；3.河北省邯鄲市食品藥品檢驗(yàn)中心，河北邯鄲 056000

柴胡，原名茈胡，為傘形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.或狹葉柴胡 Bupleurum scorzonerifolium Willd.的干燥根。按性狀不同，分別習(xí)稱“北柴胡”和“南柴胡”[1]。北柴胡主產(chǎn)于河北、河南、陜西等地，南柴胡主產(chǎn)于吉林、江蘇、安徽等地。《中國(guó)植物志》記載[2]，我國(guó)有柴胡屬植物36 種、17個(gè)變種、7個(gè)變型，具有疏散退熱，舒肝解郁，升舉陽(yáng)氣之功能，為中醫(yī)治療少陽(yáng)癥的首選要藥，是河北道地藥材之一[3-5]。

柴胡化學(xué)成分復(fù)雜，主要含有皂苷、黃酮、揮發(fā)油、有機(jī)酸、多糖類等[6-8]。藥理研究表明，柴胡具有解熱、抗病毒、降血脂、保肝、抗炎、抗腫瘤等作用[9-11]。由于藥品流通市場(chǎng)柴胡使用品種混亂，且采收時(shí)間跨度較長(zhǎng)，所以不同來源的柴胡所含皂苷類成分含量差異較大。本文建立了紫外分光光度法測(cè)定柴胡中總皂苷及HPLC 法測(cè)定柴胡皂苷a、d的方法，對(duì)13 批采自太行山區(qū)的柴胡樣品進(jìn)行定量分析，為評(píng)價(jià)太行山區(qū)柴胡質(zhì)量?jī)?yōu)劣提供數(shù)據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Sartorius BS 110S 精密天平；KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清理器；RE-2000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；UVmini-1240 紫外分光光度計(jì)；島津LC-10AT vp Plus 高效液相色譜儀，包括：二元泵，柱溫箱；Phenomenex 預(yù)柱。

1.2 試劑與材料

柴胡皂苷a 對(duì)照品 （成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)：11052402），柴胡皂苷d 對(duì)照品（成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)：12020301）；德國(guó)Merck 公司色譜乙腈；其他試劑均為分析純。

1.3 藥材來源

柴胡藥材由人工在河北、河南、山西當(dāng)?shù)夭杉?，?jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)張丹雁教授鑒定為傘形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.的干燥根。對(duì)13 批柴胡樣品進(jìn)行總皂苷及柴胡皂苷a、d 的含量測(cè)定。產(chǎn)地及來源見表1。

表1 柴胡樣品來源

2 方法與結(jié)果

2.1 總皂苷含量測(cè)定

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 參考相關(guān)文獻(xiàn)[12]，精密吸取供試品溶液與對(duì)照品溶液各0.2 mL，加入1%對(duì)二甲氨基苯甲醛乙醇溶液0.1 mL，70℃溫?zé)?0 min，取出放冷，加入磷酸4.0 mL，70℃反應(yīng) 30 min，照紫外-可見分光光度法（《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅤA）于400～800 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描（圖1）。結(jié)果在545 nm 左右有最大吸收峰，故確定檢測(cè)波長(zhǎng)為545 nm。因柴胡藥材中柴胡皂苷d 含量大于柴胡皂苷a 含量，故以柴胡皂苷d 作為研究指標(biāo)進(jìn)行總皂苷含量的測(cè)定。

2.1.2 供試品溶液的制備 取柴胡樣品和對(duì)照藥材粉末（過四號(hào)篩）0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加入5%濃氨水試液的甲醇溶液25 mL，密塞，30℃水溫超聲處理30 min，濾過，用甲醇分2 次洗滌容器及藥渣，洗液與濾液合并，回收溶劑至干。殘?jiān)由倭克芙?，再用飽和正丁醇提取，合并正丁醇液，用水洗? 次，每次20 mL，棄去水液，回收正丁醇至干，甲醇溶解，并定容至5 mL，搖勻，作為供試品溶液。

2.1.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取柴胡皂苷d 適量，加甲醇制成每毫升含0.814 mg 的溶液，即得。

圖1 柴胡皂苷d 和樣品經(jīng)顯色后的紫外掃描

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備[12]分別精密量取對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 至1 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。精密吸取對(duì)照品溶液各0.2 mL，分別加入1%對(duì)二甲氨基苯甲醛乙醇溶液0.1 mL，70℃溫?zé)?0 min，取出放冷，加入磷酸4.0 mL，70℃反應(yīng)30 min，放冷，在波長(zhǎng) 545 nm處分別測(cè)定吸光度值。以柴胡皂苷d 質(zhì)量為橫坐標(biāo)（x），吸光度值為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：y=6.441 0x－0.022 5，r=0.996 9。結(jié)果顯示，柴胡皂苷 d 在0.032 56～0.162 80 mg 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.1.5 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一份的柴胡皂苷d 溶液，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”操作，重復(fù)測(cè)定5 次，吸光度平均值為0.459，RSD 為1.51%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取11 號(hào)樣品制成的供試品溶液，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”操作，分別于配制后 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定吸光度平均值為0.656，RSD 為1.16%，表明本品在2.5 h 內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.1.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取11 號(hào)樣品，平行6 份，按“2.1.2”項(xiàng)下制備供試品溶液和“2.1.4”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定吸光度平均值為0.635，RSD 為2.06%，表明本法具有良好的重現(xiàn)性。

2.1.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱定已知含量的11 號(hào)樣品6 份，分別精密加入一定量的柴胡皂苷d 溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下制備供試品溶液和“2.1.4”項(xiàng)下方法操作，測(cè)得平均加樣回收率為99.73%，RSD 為2.07%，表明總皂苷回收率良好。結(jié)果見表2。

表2 總皂苷含量測(cè)定加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.9 13 批樣品中總皂苷的含量測(cè)定分別取13 批樣品粉末（過四號(hào)篩），按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依“2.1.4”項(xiàng)下方法操作，記錄吸光度值，并計(jì)算樣品中總皂苷的含量，結(jié)果見表3。

表3 13批樣品中總皂苷及柴胡皂苷a、d的含量測(cè)定結(jié)果（%）

2.2 柴胡皂苷a、d 的含量測(cè)定[1]

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：30℃；梯度洗脫：0～50 min：25%～90%（A）；50～55 min：90%（A）。在此色譜條件下，樣品分離良好。見圖2。

圖2 柴胡皂苷a、柴胡皂苷d 和柴胡樣品高效液相色譜圖

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品粉末（過四號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入含5%濃氨試液的甲醇溶液 25 mL，密塞，30℃水溫超聲處理 30 min，濾過，用甲醇20 mL 分2 次洗滌容器及藥渣，洗液與濾液合并，回收溶劑至干。殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至5 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取柴胡皂苷a 1.29 mg，柴胡皂苷d 1.19 mg，分別置5 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 線性關(guān)系考察分別精密吸取柴胡皂苷a、d 對(duì)照品溶液 0.1，0.25，0.5，0.75，1 mL，分別加甲醇定容至刻度，搖勻。按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL 進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積值。以柴胡皂苷a、d 的進(jìn)樣量X（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積值Y 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：柴胡皂苷a：Y=142 840X－6110.6，r=0.999 6，柴胡皂苷 a 在 0.258～2.580 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；柴胡皂苷d：Y=170 759X－1 637.5，r=0.999 7，柴胡皂苷 d 在 0.238～2.380 μg 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取柴胡皂苷d 對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣5 次，測(cè)定峰面積平均值為400 858.8，柴胡皂苷d的RSD 為1.64%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密稱取11 號(hào)樣品制成的供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件操作，分別于 0、2、4、6、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果表明，柴胡皂苷a 的RSD 為1.82%，柴胡皂苷d 的RSD 為1.58%，表明本品24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取11 號(hào)樣品6 份，分別按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，依“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件操作，結(jié)果表明，柴胡皂苷a 的RSD 為1.18%，柴胡皂苷d 的RSD 為1.03%，表明方法重現(xiàn)性良好。

2.2.8 回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱定已知含量的11 號(hào)樣品6 份，分別精密加入一定量的柴胡皂苷a、d 對(duì)照品溶液，分別按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，依“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件操作，計(jì)算回收率，柴胡皂苷a 的平均回收率為100.40%，RSD 為1.72%；柴胡皂苷d 的平均回收率為99.70%，RSD為1.50%。

2.2.9 13 批樣品中柴胡皂苷a、d 的含量測(cè)定分別取13批樣品粉末（過四號(hào)篩），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄柴胡皂苷a、d的峰面積，并計(jì)算其含量，結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 總皂苷含量測(cè)定方法的選擇

比較香草醛-高氯酸顯色法[13-15]和對(duì)二甲氨基苯甲醛-磷酸顯色法發(fā)現(xiàn)，香草醛-高氯酸顯色法下供試品與對(duì)照品在相同波長(zhǎng)下沒有共同吸收峰，而對(duì)二甲氨基苯甲醛-磷酸顯色法下供試品與對(duì)照品在相同波長(zhǎng)（545 nm）下有共同吸收峰，且吸光度值正常，故選擇對(duì)二甲氨基苯甲醛-磷酸顯色法。

3.2 含量測(cè)定

太行山區(qū)不同采收時(shí)間的柴胡樣品中總皂苷及柴胡皂苷a、d 的含量相差比較大，柴胡皂苷a、d 高者，總皂苷不一定高，反之亦然。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，5 號(hào)和6 號(hào)樣品中總皂苷及柴胡皂苷a、d 三者含量均很低，低于《中國(guó)藥典》2010年版規(guī)定 “柴胡中柴胡皂苷a 和d 的總量不得少于0.30%”，因此，其藥用價(jià)值值得商榷[16]。10 號(hào)樣品中柴胡皂苷柴胡皂苷a 和d 的總量為0.34%，總皂苷含量達(dá)到1.14%；而13 號(hào)樣品總皂苷含量為0.87%，柴胡皂苷a 和d的總量達(dá)到0.71%。所以，應(yīng)綜合考察柴胡皂苷a、d 及總皂苷三者的含量來評(píng)價(jià)柴胡的質(zhì)量，只有三者均高才是質(zhì)量最佳。

本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法和紫外分光光度法對(duì)柴胡中柴胡皂苷a、d 和總皂苷的含量進(jìn)行測(cè)定，建立了各自的測(cè)定方法，其方法穩(wěn)定可靠、簡(jiǎn)便易行快速，結(jié)果準(zhǔn)確。不過，本研究?jī)H對(duì)采自太行山區(qū)的13批柴胡樣品進(jìn)行含量測(cè)定研究，所用樣品數(shù)量有限，后期擬將對(duì)不同來源以及不同采收季節(jié)的柴胡樣品進(jìn)行廣泛的研究，為進(jìn)一步考察太行山區(qū)的柴胡質(zhì)量提供依據(jù)。

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