HPLC-ELSD 法測(cè)定八角茴香中莽草酸的含量

唐 霖 裴利霞

1.浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校，浙江寧波 315100；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院中藥藥理實(shí)驗(yàn)室，上海 200032

八角茴香，常綠喬木，高達(dá)20 m。其聚合果含大量莽草酸，常由8個(gè)骨突果生在中軸呈星狀，外表面紅棕色，有不規(guī)則皺紋，頂端呈鳥喙?fàn)睿蟼?cè)多開裂[1]。主產(chǎn)廣西、廣東、云南等地[2]。莽草酸是從中藥八角茴香中提取的一種單體化合物，有抗炎、鎮(zhèn)痛作用，是抗癌藥物中間體。有明顯抗血栓形成作用，可抑制動(dòng)、靜脈血栓及腦血栓形成[3]。莽草酸是世界上對(duì)付禽流感的唯一武器，莽草酸是可有效對(duì)付致命的H5N1禽流感病毒的藥物“達(dá)菲”的重要成分。

莽草酸（shikimic acid）為三萜酸，結(jié)構(gòu)式見圖1。它是有機(jī)弱酸，在水溶液中易解離。現(xiàn)有的HPLC 分析檢測(cè)方法主要有以下幾種：①直接用ODS 柱測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)莽草酸不經(jīng)吸附就可直接出峰。為了在常規(guī)的ODS 柱上延長莽草酸的保留時(shí)間，一般要加入磷酸緩沖鹽溶液[4]，或強(qiáng)酸溶液（HClO4，pH=2.5）[5-6]，或離子對(duì)試劑[7]。但是，磷酸鹽緩沖液系統(tǒng)和強(qiáng)酸溶液會(huì)增加對(duì)反相色譜柱損壞的程度。②采用氨基鍵合相硅膠柱[8]，不需要加入強(qiáng)酸做流動(dòng)相，即可獲得令人滿意的分離效果。③在檢測(cè)波長的選擇方面，現(xiàn)有文獻(xiàn)均用213 nm 左右的波長進(jìn)行測(cè)定，但是該吸收峰接近末端吸收，易受雜質(zhì)干擾。相比之下，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（evaporative light-scattering detector，ELSD）由于其獨(dú)特的檢測(cè)原理卻可以克服紫外檢測(cè)器的不足，這是因?yàn)镋LSD 檢測(cè)器適用于分析沒有紫外吸收或者只有末端吸收的成分，其響應(yīng)不依賴于樣品的光學(xué)特性，任何揮發(fā)性低于流動(dòng)相的樣品均能被檢測(cè)。ELSD 的響應(yīng)值與樣品的質(zhì)量成正比，因而能用于測(cè)定樣品的純度或者檢測(cè)未知物。因此，為了提高莽草酸含量測(cè)定的準(zhǔn)確性，本文選擇了氨基鍵合相硅膠柱和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器進(jìn)行含量測(cè)定研究。

圖1 莽草酸的結(jié)構(gòu)式

1 儀器與試藥

Agilent 1100 HPLC，Alltech 2000 型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；色譜柱：Hypersil NH2柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），大連伊利特。

莽草酸標(biāo)準(zhǔn)品（蕪湖甙爾塔醫(yī)藥科技有限公司，純度98%）；八角茴香藥材購于廣西并由浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校王和平教授鑒定為八角茴香Illicium verum Hook.F.。乙腈為色譜純（Fisher 公司），甲酸（分析純），水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取莽草酸28.5 mg，用甲醇溶于25 mL 量瓶中，定容至刻度，搖勻，作為莽草酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液5 mL，置10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻作為莽草酸的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，濃度為0.57 mg/min。

2.2 供試品溶液的制備

取本品粉末（過3 號(hào)篩）0.5 g，精密稱定置100 mL 具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，搖勻，稱定質(zhì)量；超聲處理（功率250 W，頻率30 kHz）40 min，室溫放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻。以0.45 μm 濾膜過濾，取濾液，即得。

2.3 含量測(cè)定

2.3.1 液相條件 柱溫：30℃，流動(dòng)相：乙腈-水（80∶20，均含0.1%甲酸），流速1.0 mL/min，漂移管溫度100℃，載氣流速2.5 L/min。進(jìn)樣量10 μL。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品色譜分離見圖2、3。

圖2 莽草酸標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜

圖3 樣品高效液相色譜

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取上述莽草酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0.57 mg/mL），然后按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件，分別精密吸取 1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 μL 注入液相色譜儀，分析并記錄結(jié)果（色譜峰面積）。以標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，峰面積A 為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸，得莽草酸回歸方程及相關(guān)系數(shù)如下：Y=550.797 6X+72.557 9，r=0.999 9。結(jié)果表明，莽草酸進(jìn)樣量在0.57～11.40 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取莽草酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液 （0.57 mg/mL），重復(fù)進(jìn)樣5 次，每次10 μL，記錄色譜峰面積，RSD 為1.26%。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批八角茴香藥材，按“2.2”項(xiàng)下方法，重復(fù)5 次取樣制備供試品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下方法測(cè)定并計(jì)算含量，莽草酸含量的RSD 為1.79%。

2.3.5 回收率試驗(yàn) 取已知含量（5.84%）的同一批八角茴香藥材，精密稱取5 份，每份約0.05 g，分別精密加入莽草酸對(duì)照品溶液（1.14 mg/mL）3 mL，然后按“2.3.2”項(xiàng)下方法測(cè)定含量，并計(jì)算回收率，具體結(jié)果見表1。

表1 樣品回收率測(cè)定結(jié)果（n=6）

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 稱取八角茴香樣品0.5 g，按“2.2”項(xiàng)下方法處理，得供試品溶液，分別于 0、2、4、6、10、16、24 h 測(cè)定莽草酸含量，記錄相應(yīng)峰面積，計(jì)算5 次進(jìn)樣測(cè)得峰面積的RSD 值。結(jié)果莽草酸峰面積的RSD 為1.43%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)基本保持穩(wěn)定。

3 討論

3.1 色譜柱的選擇

本實(shí)驗(yàn)對(duì)ODS 柱和NH2 柱的分離效果進(jìn)行了比較。直接用ODS 柱測(cè)定，發(fā)現(xiàn)莽草酸不經(jīng)吸附就直接出峰。考慮到這可能是由于莽草酸的電離引起的，而在NH2柱上莽草酸可以獲得較好的分離。

3.2 流動(dòng)相的酸度

發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相的酸度對(duì)莽草酸的保留時(shí)間有較大影響，流動(dòng)相（含0.1%甲酸）室溫放置2 d 后，莽草酸的保留時(shí)間明顯延后（從9 min 延長到12 min）。因此提示流動(dòng)相要臨用現(xiàn)配。

3.3 檢測(cè)器的選擇

通過對(duì)莽草酸現(xiàn)有檢測(cè)方法的考察，發(fā)現(xiàn)常規(guī)紫外檢測(cè)中存在著末端吸收的問題，為了避免該問題，本文選擇了更具通用性的蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，該方法具有簡便快速、結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好的特點(diǎn)。

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