HPLC法同時測定白芍、甘草藥對提取物中9種有效成分

李 妍， 楊燕云， 張振秋， 侯學智， 楊 超

(遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧大連116600)

芍藥甘草湯系東漢張仲景《傷寒論·太陽篇》的著名方劑，是常用的緩急止痛之方，由白芍和炙甘草等組成，方中白芍與炙甘草配伍比例為1∶1，主營陰不足、肝脾不和，癥見脘腹諸痛，四肢攣急等證候。芍藥甘草湯總有效部位 (TPG)，由芍藥總苷、甘草總苷、甘草總黃酮3部分組成［1］。芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和苯甲酰芍藥苷等單萜類成分為白芍總苷的主要活性成分［2］，甘草苷、芹糖基甘草苷、芹糖基異甘草苷為甘草總苷的代表成分，甘草素、異甘草素為甘草黃酮的代表成分;此外，白芍所含1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖，甘草所含甘草酸亦具有明確的藥理活性［3-4］。

《中國藥典》2010年版 (一部)對白芍、甘草單味藥材中芍藥苷、甘草苷、甘草酸分別進行了定量測定［5］。現(xiàn)有文獻，多是以芍藥苷、甘草苷、甘草素、甘草酸為指標性成分進行的定量測定［1，6-9］，而上述其他藥理活性成分卻鮮有報道。因此本實驗從文獻報道的白芍甘草藥對提取物中有效成分出發(fā)建立了高效液相波長切換法，同時測定了芍藥內(nèi)酯苷 (Ⅰ)、芍藥苷 (Ⅱ)、甘草苷(Ⅲ)、1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖 (Ⅳ)、芹糖基異甘草苷 (Ⅴ)、異甘草苷 (Ⅵ)、苯甲酰芍藥苷 (Ⅶ)、甘草酸 (Ⅷ)、異甘草素 (Ⅸ)9個藥理活性成分，為更加全面的科學評價白芍甘草藥對提取物的質(zhì)量奠定基礎。

1 儀器與試藥

Agilent-1100型高效液相色譜儀 (儀器編號:20041191 DE43607375)，配置四元梯度泵、在線脫氣機、VWD檢測器;AS3120A超聲提取器 (天津奧特賽恩斯儀器有限公司);2140型電子分析天平(上海奧豪斯公司)、METTLER AB135-S十萬分之一電子天平 (瑞士);U-3010型紫外-可見分光光度計 (日立公司)。

對照品甘草苷 (批號:111610-200604)購于中國食品藥品檢定研究所;異甘草素 (批號:20100603)、苯甲酰芍藥苷 (批號:20100513)均購于天津一方科技有限公司;芹糖基異甘草苷(批號:20101108)、異甘草苷 (批號:20100915)均購于上海永恒生物科技有限公司;甘草酸 (批號:20100730)、芍藥苷 (批號:20100821)均購于上海融禾科技有限公司;芍藥內(nèi)酯苷 (批號:20100325)、1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖(批號:20100706)均購于深圳美荷生物科技有限公司，純度均為98%。

本研究所用的白芍飲片、炙甘草飲片均購于河北安國，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學李峰教授鑒定分別為芍藥Paeonia lactiflora Pall．的干燥根、甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch．的干燥根及根莖。

藥對提取物制備 取白芍、炙甘草中粉1∶1，100 g，8倍量水煎煮2次，每次60 min，濾過，合并濾液濃縮，于70℃減壓干燥至恒定質(zhì)量，即得。

乙腈、甲醇為色譜純 (山東禹王化學試劑公司)，水為重蒸餾水，磷酸、三氯甲烷為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 混合對照品溶液 精密稱取9個對照品適量，分別加甲醇制成芍藥內(nèi)酯苷質(zhì)量濃度為0.058 89 mg/mL、芍藥苷質(zhì)量濃度為0.081 50 mg/mL、甘草苷質(zhì)量濃度為0.067 91 mg/mL、1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖質(zhì)量濃度為0.064 38 mg/mL、芹糖異甘草苷質(zhì)量濃度為0.076 47 mg/mL、異甘草苷質(zhì)量濃度為0.062 28mg/mL、苯甲酰芍藥苷質(zhì)量濃度為0.072 67 mg/mL、甘草酸質(zhì)量濃度為0.098 91 mg/mL、異甘草素質(zhì)量濃度為0.061 25 mg/mL的單一對照品貯備液，備用。依次精密量取上述9個對照品貯備液0.95、2.25、1.10、0.20、0.95、0.35、0.30、2.30、0.02 mL，置同一25mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成每1mL芍藥內(nèi)酯苷2.238μg、芍藥苷7.335μg、甘草苷2.988 μg、1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖0.515μg、芹糖異甘草苷2.906μg、異甘草苷0.872 μg、苯甲酰芍藥苷0.491μg、甘草酸9.100μg、異甘草素0.049μg的混合溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液 取藥對提取物0.1 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入水25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理 (功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用水補足損失的質(zhì)量，搖勻;精密移取續(xù)濾液10mL于分液漏斗中，加入乙腈20 mL，三氯甲烷20 mL，靜置分層，將水層全部取出至10 mL量瓶，加水至刻線，搖勻;0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件 Dikma Technologies-C18色譜柱(200 mm×4.6 mm，5μm);流動相:乙腈 (A)-0.1%磷酸水 (B)，梯度洗脫 (0～5 min，5%A→10%A;5～10 min，10%A→12%A;10～15 min，12%A→14%A;15～20 min，14%A→16%A;20～25min，16%A→18%A;25～30 min，18%A→20%A;30～40 min，20%A→25%A;40～50 min，25%A→40%A;50～62 min，40%A→55%A;62～72 min，55%A→70%A;72～85 min，70%A→55%A;85～95 min，55%A→5%A)，體積流量 1.0 mL/min，檢測波長為267 nm(0～13min)、258 nm(13～17min)、230 nm(17～27min)、276 nm(27～42 min)、360 nm(42～46 min)、276 nm(46～50 min)、230 nm(50～53 min)、275 nm(53～55 min)、250 nm(55～95 min);柱溫30℃;進樣量20μL。在上述色譜條件下，以甘草酸計算理論塔板數(shù)大于300 000，分離度大于1.5。對照品、樣品以及2種藥材的陰性色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品 (A)、樣品(B)、白芍陰性液(C)、炙甘草陰性液(D)HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms ofm ixed reference substance(A)、samp le(B)、negative sample w ithout Paeoniae Radix alba(C)、negative sample w ithout Glycyrrhizae Radix et Rhizoma(D)

2.3 線性關系的考察 分別精密量取上述混合對照品溶液2、5、10、15、20μL注入高效液相色譜儀，測定。以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程，結果見表1。

表1 9個成分的標準曲線方程、相關系數(shù)和線性范圍Tab.1 Regression equations，correlation coefficients，and linear ranges of nine constituents

2.4 精密度試驗 精密吸取供試品溶液20μL，按2.2項下色譜條件連續(xù)進樣5次，測得1～9峰面積的 RSD(n=5)分別為 2.0%、1.6%、2.3%、1.6%、1.6%、2.1%、1.8%、1.8%、2.1%。結果表明，儀器精密度較好。

2.5 重復性試驗 精密稱取藥對提取物0.1 g，共6份。按2.1.3項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進樣20μL，測得芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖、芹糖基異甘草苷、異甘草苷、苯甲酰芍藥苷、甘草酸、異甘草素平均質(zhì)量分數(shù) (n=6)分別為8.755、 33.82、 13.95、 1.258、 8.005、 1.766、2.344、51.40、0.135 4 mg/g;RSD分別為1.2%、1.6%、1.9%、1.5%、1.3%、1.6%、1.8%、2.0%、1.7%。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，在室溫下放置，分別于0、2、4、6、8、12、24 h進樣20μL分析，測定峰面積。1～9峰面積的RSD(n=7)分別 為 1.3%、1.7%、1.6%、 1.7%、1.9%、1.1%、1.2%、1.9%、1.7%。結果表明，供試品溶液中9個化合物在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗 取已知含有量 (芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖、芹糖基異甘草苷、異甘草苷、苯甲酰芍藥苷、甘草酸、異甘草素質(zhì)量分數(shù)分別為8.755、33.82、 13.95、 1.258、 8.005、 1.766、 2.344、51.40、0.135 4 mg/g的提取物5份，每份約0.05 g，精密稱定。依次精密移取上述單一對照品貯備液 0.85、2.35、1.20、0.10、0.60、0.15、0.20、2.95、0.013 mL，置同一50 mL具塞錐形瓶中，按2.1.2項下方法制備供試溶液，在上述色譜條件下進行測定，計算回收率。結果上述成分的平均回收率 (n=5)分別為98.5%、103.4%、102.7%、98.2%、96.4%、96.3%、102.7%、102.6%、96.4%;RSD分別為 2.5%、2.0%、1.1%、2.3%、1.3%、1.4%、2.0%、1.7%、1.2%。見表2。

2.8 樣品測定 取3批白芍、炙甘草1∶1藥對提取物0.1 g，精密稱定。按2.1.2項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進樣測定，精密吸取供試品溶液20μL，分別注入液相色譜儀，在記錄色譜圖并以外標法計算樣品中9個指標成分的質(zhì)量分數(shù)，結果見表3。

表2 9個成分回收率考察Tab.2 Results of recovery tests of nine constituents

3 討論

3.1 本實驗以芍藥苷、甘草酸為評價指標，經(jīng)考察回流提取2 h和超聲提取30 min提取方式發(fā)現(xiàn)，回流提取與超聲提取結果差別不大，超聲提取簡單方便，故采用超聲提取法。又考察了甲醇、乙醇、水3種提取溶劑發(fā)現(xiàn)水的提取效果最好。采用L9(34)正交試驗法，選擇溶劑量、提取次數(shù)、提取時間3個因素，進行3水平考察。采用綜合評分法進行數(shù)據(jù)分析 (權重系數(shù)為0.5)。最終確定最佳提取工藝為水提取1次，每次30 min。

表3 9種指標成分測定結果(n=4)Tab.3 Analytical results of nine constituents(n=4)

3.2 在2.4項線性關系的考察中，按標準曲線的最小進樣量進樣時，信噪比均大于30，可用于準確定量。

3.3 依據(jù)有關文獻［10-12］，本實驗建立了HPLC波長切換方法，測定了白芍甘草藥對中9個有效成分的量，以保證各成分在檢測波長處有最大吸收。芍藥內(nèi)酯苷的最大吸收波長在300 nm，但由于芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷保留時間比較接近，如果切換波長會導致基線嚴重漂移，所以芍藥內(nèi)酯苷的檢測波長選擇了230 nm，沒有在最大波長處檢測。同樣，異甘草素的最大吸收波長在370 nm，異甘草素和甘草酸的保留時間比較接近，因此異甘草素的檢測波長選擇了250 nm，其他各成分均在其最大吸收波長處檢測。9個成分的具體檢測波長如下:芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷為230 nm;甘草苷、1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖為276 nm;芹糖基異甘草苷、異甘草苷為360 nm;苯甲酰芍藥苷為230 nm;甘草酸、異甘草素為250 nm。

3.4 采用本研究建立的方法對3批白芍甘草藥對提取物中9個指標成分進行了定量測定。結果表明，9個指標性成分之間含有量差別不大，芍藥內(nèi)酯苷的質(zhì)量分數(shù)8.687～8.722 mg/g、芍藥苷的質(zhì)量分數(shù)33.25～33.80 mg/g、甘草苷的質(zhì)量分數(shù)13.69 ～ 13.78 mg/g、1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖的質(zhì)量分數(shù)1.261～1.266 mg/g、芹糖異甘草苷的質(zhì)量分數(shù)7.951～7.986 mg/g、異甘草苷的質(zhì)量分數(shù)1.765～1.778 mg/g、苯甲酰芍藥苷的質(zhì)量分數(shù)2.291～2.322 mg/g、甘草酸的質(zhì)量分數(shù)51.06～51.55 mg/g、異甘草素的質(zhì)量分數(shù)0.134 0～0.135 4 mg/g。本實驗立足芍藥甘草湯方中重要的藥理有效成分，建立波長切換HPLC法同時測定了白芍炙甘草藥對提取物中9個有效成分，方法簡便、快捷、重復性好，在該藥對的定量測定方面具有一定的創(chuàng)新性，可為全面的科學評價芍藥甘草湯質(zhì)量提供依據(jù)。

［1］楊玲娟，趙曉莉，狄留慶，等．HPLC法測定芍藥甘草湯總有效部位中4個活性成分的含量［J］．中華中醫(yī)藥學刊，2007，25(3):522．

［2］張曉燕，王金輝，李 銑．白芍的化學成分研究［J］．沈陽藥科大學學報，2001，18(1):30．

［3］Lee S J，Lee H M，Ji S T，et al．1，2，3，4，6-penta-O-galloyl-D-glucose blocks endothelial cell growth and tubeformation through inhibition of VEGF binding to VEGF receptor ［J］．Cancer Lett，2004，208(1):89-94．

［4］田慶來，官月平，張 波，等．甘草有效成分的藥理作用研究進展 ［J］．天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2006，18(2):343．

［5］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:96，80．

［6］楊書良，王 華，楊 波．HPLC法測定芍甘合劑中芍藥苷及甘草苷含量［J］．黑龍江醫(yī)藥，2008，21(6):2．

［7］段天璇，于密密，劉春生，等．HPLC法同時測定甘草指紋圖譜暨甘草苷、甘草酸含量 ［J］．中成藥，2006，28(2):161-165．

［8］猶 衛(wèi)，王 敏，馬天俊．HPLC法測定復方甘草合劑中甘草苷的含量 ［J］．資源開發(fā)與市場，2005，21(6):491-492，506．

［9］丘振文，羅丹冬，任結梅，等．不同劑量配比對芍藥甘草湯中芍藥苷煎出量的影響［J］．時珍國醫(yī)國藥，2008，19(6):1454-1455．

［10］王 冰，張振秋，孫艷濤．HPLC切換波長法同時測定升麻中5種成分的含量 ［J］．藥物分析雜志，2011，31(2):391-394．

［11］李玉恒，張振秋，賴靜怡，等．HPLC波長切換技術同時測定萸連片中7種成分含量 ［J］．藥物分析雜志，2011，31(2):371-375．

［12］毛泉明，葉福媛，張鈺泉，等．桂枝湯多指標定量法HPLC條件的研究［J］．上海中醫(yī)藥雜志，2007，41(7):72-74．