HPLC法測(cè)定秋水仙藥材中秋水仙堿

李 巖， 李曉靜，， 程雪梅， 王崢濤， 王長(zhǎng)虹*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥劑教研室，新疆烏魯木齊830011;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所;中藥標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;中藥新資源與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)綜合評(píng)價(jià)國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)研究室;上海市復(fù)方中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201210)

維藥秋水仙為百合科植物秋水仙Colchicum autumnale L．的干燥鱗莖，收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)《維吾爾藥分冊(cè)》，其性質(zhì)為二級(jí)干，三級(jí)熱，具有生干生熱，祛風(fēng)止痛，通阻除黃、祛寒助陽的功效，用于治療大小關(guān)節(jié)骨痛(風(fēng)濕性和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)、肝炎、黃疸等癥［1-3］。秋水仙堿 (colchicine)是秋水仙中主要有效成分，具有抗痛風(fēng)、抗腫瘤、抗肝炎等多種藥理作用，對(duì)某些癌癥和原發(fā)性痛風(fēng)有特異性作用［4-6］，但毒性較大［7］。部頒秋水仙藥材標(biāo)準(zhǔn)中僅規(guī)定了性狀、顯微鑒別等質(zhì)量控制項(xiàng)目，尚無定量檢測(cè)方法和指標(biāo)［1］。目前文獻(xiàn)報(bào)道的有關(guān)秋水仙堿的定量測(cè)定以HPLC法為主，但均是對(duì)秋水仙堿片［8-9］或秋水仙堿原料［10］、麗江山慈姑［11］、及含秋水仙的復(fù)方制劑［12-13］中的秋水仙堿的定量測(cè)定，而對(duì)秋水仙藥材中秋水仙堿的定量測(cè)定方法尚未見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法對(duì)秋水仙藥材中秋水仙堿進(jìn)行測(cè)定，為藥材的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters2695高效液相色譜儀 (Empower Pro色譜數(shù)據(jù)工作站，996二極管陣列檢測(cè)器，600四元泵，717plus自動(dòng)進(jìn)樣器，在線脫氣機(jī)，Waters Co．);分析色譜柱Symmetrix ODS-H(4.6 mm ×250 mm，5μm);BP211D Sartorius電子天平 (Sartourius Co．GM);超純水器 (Millipore公司);KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)。

秋水仙 (批號(hào) 20111002-1、20111002-2、20111002-3，由安徽德昌藥業(yè)飲片有限公司提供，產(chǎn)地為新疆;批號(hào)Y090130、Y090186、Y091126、Y110621，新疆維吾爾藥業(yè)有限責(zé)任公司提供，進(jìn)口)，由吳立宏副研究員鑒定為百合科植物秋水仙Colchicum autumnale L．的干燥鱗莖，憑證標(biāo)本存放于上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心標(biāo)本室;秋水仙堿對(duì)照品 (中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):101176-201001);乙腈 (色譜純，F(xiàn)isher);甲醇為色譜純;水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取秋水仙堿對(duì)照品12.50 mg，置25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得500μg/mL秋水仙堿對(duì)照品貯備液。

2.2 供試品溶液的制備 取秋水仙藥材粉末 (過4號(hào)篩)約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理60min(功率250W，頻率50 kHz)，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，濾液用微孔濾膜 (0.45μm)濾過，即得。

2.3 色譜條件 Symmetrix ODS-H色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5μm);流動(dòng)相為乙腈-0.1% 三氟乙酸 (28:72);檢測(cè)波長(zhǎng)350 nm;體積流量1.0 mL/min;柱溫30℃。在此條件下，秋水仙堿與樣品中其他成分達(dá)到基線分離 (見圖1)。

2.4 線性關(guān)系的考察 精密量取秋水仙堿對(duì)照品貯備液0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mL分別置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制得質(zhì)量濃度為2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0μg/mL的秋水仙堿對(duì)照品溶液。取以上各質(zhì)量濃度秋水仙堿對(duì)照品溶液10μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，以峰面積 (Y)為縱坐標(biāo)，秋水仙堿對(duì)照品質(zhì)量濃度 (X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=22 704X+16 218，r=0.999 9(n=7)，線性范圍為2.5～160 μg/mL。

圖1 秋水仙堿對(duì)照品 (A)和秋水仙供試品(B)的HPLC圖

2.5 最低檢測(cè)限 將秋水仙堿對(duì)照品溶液按逐步稀釋法稀釋，測(cè)定其最低檢測(cè)限。信噪比約為3∶1時(shí)，秋水仙堿的最低檢測(cè)限5.00 ng。

2.6 穩(wěn)定性考察 取供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24、72 h測(cè)定，計(jì)算秋水仙堿的含有量及RSD，結(jié)果RSD為0.94%。

2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取秋水仙堿對(duì)照品貯備液0.1、1.0、3.0 mL分別置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度。分別于1 d內(nèi)間隔相等時(shí)間分別測(cè)定5次計(jì)算日內(nèi)精密度;連續(xù)測(cè)定3 d，進(jìn)行日間精密度測(cè)試結(jié)果見表1。日內(nèi)精密度RSD分別為0.86%、0.54%、0.43%;日間精密度RSD分別為1.35%、0.64%、0.50%;日內(nèi)和日間精密度均小于1.5%，說明日內(nèi)、日間精密度良好。

表1 日內(nèi)、日間精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品，按供試品溶液的制備方法制備6份供試品溶液，計(jì)算秋水仙堿的含有量及RSD，結(jié)果RSD為0.96%，表明方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已準(zhǔn)確測(cè)定的秋水仙樣品粉末約0.5 g，共9份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入各對(duì)照品溶液適量，按供試品溶液的制備方法處理，測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的加樣回收率為 (96.37±1.02)%，RSD小于2.0%。

表2 回收率測(cè)定結(jié)果(n=3)

2.10 樣品測(cè)定 將3批秋水仙藥材按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下，分別進(jìn)樣10μL測(cè)定，記錄各個(gè)峰面積，分別計(jì)算秋水仙中秋水仙堿的量，結(jié)果見表3。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 本實(shí)驗(yàn)比較了用20、50、100倍的溶劑量，分別以回流、超聲等方法進(jìn)行提取，結(jié)果以超聲提取法簡(jiǎn)便快捷，提取效果好。50倍溶劑量和100倍溶劑量相比，提取效果無差別，因此，選用相當(dāng)于藥材量的50倍溶劑量超聲提取法制備供試品溶液。

3.2 文獻(xiàn)報(bào)道HPLC法用于秋水仙堿測(cè)定的報(bào)道中，大多采用磷酸二氫鉀-甲醇系統(tǒng)作為流動(dòng)相［8，12-13］，而本實(shí)驗(yàn)采用不含鹽的兩相系統(tǒng) (乙腈-0.1%三氟乙酸)作為流動(dòng)相，組成簡(jiǎn)單，且能更好的保護(hù)色譜柱。

3.3 本實(shí)驗(yàn)對(duì)7批不同來源的秋水仙藥材進(jìn)行了測(cè)定，不同批次的藥材中秋水仙堿量差異較大。對(duì)藥材中秋水仙堿建立適宜的限度標(biāo)準(zhǔn)，從而對(duì)藥材進(jìn)行質(zhì)量控制具有重要的意義。從結(jié)果可以看出，進(jìn)口藥材中秋水仙堿量比國(guó)產(chǎn)相對(duì)偏低，其原因還待于進(jìn)一步研究。本測(cè)定方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定性良好，可為秋水仙的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

［1］衛(wèi)生部藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn):維吾爾藥分冊(cè)［S］．烏魯木齊:新疆科技衛(wèi)生出版社，1999:72．

［2］國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì)．中華本草:維吾爾藥卷［M］．上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，2005:281-283．

［3］劉勇民．維吾爾藥志:下冊(cè)［M］．烏魯木齊:新疆科技衛(wèi)生出版社，1999:588-592．

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