酸性白土吸附茶多酚中咖啡因的工藝研究

王兆豐， 張 繼， 武偉國， 于 佳

(西北師范大學生命科學學院，甘肅特色植物有效成分制品工程技術研究中心，甘肅蘭州730070)

茶多酚是一種性能優良的天然食品添加劑和效果顯著的醫藥保健品，應用領域十分廣闊［1］，我國于1990年制定了相應的國家標準，開始在食品工業、醫藥行業和日用化工業等領域廣泛地應用［2］。研究表明，茶多酚安全無毒，具有清除自由基、抗氧化、抗艾滋病、抑制腫瘤、抑制乙肝病毒和調節免疫力等作用，對人體多種病癥的預防與治療起著重大作用［3-5］。茶多酚的主要成分是兒茶素類，同時含有少量咖啡因。咖啡因能促進人體生熱和脂肪氧化，刺激中樞神經系統興奮［6］，具有強心、利尿的作用，但過量攝取可能產生失眠、墮胎或流產、神經過敏等有害作用［7］。因此，茶多酚中的咖啡因量決定了茶多酚的應用范圍，在醫藥保健領域，咖啡因質量分數要求低于1%，在其它應用領域對咖啡因量又有著特殊的要求［8］。普通商品茶多酚中咖啡因質量分數為2%～10%，遠高于茶葉中的咖啡因量。人們一直在探索從茶多酚中脫除咖啡因的方法，常用的有層析法、吸附法、離子沉淀法、有機溶劑或超臨界CO2萃取法和微生物或酶降解法等，其中吸附法相對應用較廣。咖啡因具有多羥基嘌呤環和共軛雙鍵，易被多孔性物質 (如活性炭、硅藻土、活性黏土和纖維素等)所吸附，酸性白土主要指玻璃質火山巖分解后的產物，其主要化學成分是Al2O3、SiO2、水及少量鐵、鎂、鈣等，無可塑性，具有多孔性和較強吸附性，吸水后不膨脹。本實驗使用酸性白土，探究其脫除茶多酚中咖啡因的最佳工藝條件。

1 材料、試劑及儀器

1.1 材料 隴南夏秋茶葉:甘肅康縣茗芝茶葉有限公司，粉碎，過60目篩。

1.2 試劑 沒食子酸 (GA，≥98%)、兒茶素 (C，≥98%)、表兒茶素 (EC，≥98%)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯 (EGCG，≥99%)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG，≥98%)、表兒茶素沒食子酸酯 (ECG，≥98%)和咖啡因 (CAF，99.2%)等對照品購自Aladdin Chemistry Co．Ltd。甲醇、乙酸為色譜純，購自天津市凱信化學工業有限公司。乙腈為色譜純，購自Fisher ChemAlert;超純水;酸性白土購自遼寧省義縣石油白土廠。

1.3 儀器 MG08S-2B微波試驗儀 (南京匯研微波系統工程有限公司);ML-902定時恒溫磁力攪拌器 (上海浦江分析儀器廠);N-1001旋轉蒸發儀 (上海愛郎儀器有限公司);優普超純水機 (成都超純水科技有限公司);TDL5M臺式大容量冷凍離心機 (湘儀離心機儀器有限公司);LGJ-18S冷凍干燥機 (北京松源華興科技發展有限公司);AW 320電子天平 (Shimdzu Corporation);Ultimate 3000戴安分析型高效液相色譜儀 (美國戴安公司);AP-01P真空泵 (天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。

2 方法

2.1 茶多酚中咖啡因和兒茶素類的測定 用高效液相色譜法 (HPLC)定量測定茶多酚中的咖啡因和兒茶素類。測定條件如下:AT．Lichrom ODS色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);乙腈-乙酸-水 (9∶0.5∶90.5)為流動相A，乙腈-乙酸-水 (80∶0.5∶19.5)為流動相B，按表1中的規定進行梯度洗脫;體積流量1.0 mL/min;柱溫35℃;檢測波長278 nm。

表1 色譜條件

標準曲線 分別稱取沒食子酸3.0 mg、兒茶素10.0 mg、表兒茶素10.0 mg、表沒食子兒茶素沒食子酸酯30.0 mg、沒食子兒茶素沒食子酸酯15.0 mg、表兒茶素沒食子酸酯25.0 mg和咖啡因5.0 mg至100 mL量瓶中，10%乙腈溶解后定容至刻度，配成沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯和咖啡因的質量濃度分別為30、100、100、300、150、250、50 mg/L的混合溶液，用0.45μm濾膜過濾，即得兒茶素類和咖啡因的對照品混合溶液。移取1.0 mL兒茶素類和咖啡因的對照品混合溶液，梯度稀釋至0、2、4、6、8、10倍。準確吸取20μL兒茶素類和咖啡因對照品的混合溶液的稀釋液，在Ultimate 3000戴安分析型高效液相色譜儀上進行檢測，以對照品質量濃度X(mg/L)為橫坐標，相應的色譜峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線，得出回歸方程。

測定茶多酚中咖啡因和兒茶素類的量 精確稱取0.01 g茶多酚于10 m L量瓶中，10%乙腈溶解后定容至刻度，用0.45μm濾膜過濾，即得茶多酚的樣品溶液。精密吸取20μL茶多酚的樣品溶液，在Ultimate 3000戴安分析型高效液相色譜儀上進行檢測，根據標準曲線和測得的色譜峰面積計算茶多酚中咖啡因和兒茶素類的量。

2.2 酸性白土吸附茶多酚中咖啡因的技術路線 將茶葉用粉碎機粉碎，過60目篩。準確稱取茶末6.0 g，加超純水120 mL，于MG08S-2B微波試驗儀中80℃浸提60 min，微波輻照功率600 W［9］。對提取液立即進行減壓抽濾，濾液即為茶多酚提取液。準確量取100 mL茶多酚提取液，加入3.0 g酸性白土，120 r/min機械攪拌下吸附3次，每次40 min。吸附后的茶多酚提取液于TDL5M冷凍離心機上4 000 r/min離心10 min，上清液于N-1001旋轉蒸發儀上濃縮，將濃縮液置于預先稱定質量的培養皿上，于LGJ-18S冷凍干燥機上干燥即可。稱定培養皿質量并計算茶多酚質量，按2.1項中的方法測定咖啡因及兒茶素類的量。

2.3 酸性白土吸附茶多酚中咖啡因的工藝優化

2.3.1 單因素試驗 考察酸性白土用量、吸附時間、吸附次數和攪拌速率對酸性白土吸附茶多酚中咖啡因效果的影響。單因素試驗設計如下:(1)酸性白土用量:酸性白土用量10、20、30、40、50 g/L，吸附時間20 min，吸附次數1次，攪拌速率120 r/min;(2)吸附時間:酸性白土用量30 g/L，吸附時間20、40、60、80、100 min，吸附次數1次，攪拌速率120 r/min;(3)吸附次數:酸性白土用量30 g/L，吸附時間40 min，吸附次數1、2、3、4、5次，攪拌速率120 r/min;(4)攪拌速率:酸性白土用量30 g/L，吸附時間40 min，吸附次數3次，攪拌速率40、80、120、160、200 r/min;

2.3.2 正交試驗 在單因素試驗的基礎上，設計4因素3水平L9(34)正交試驗，因素及水平見表2。

表2 正交試驗因素水平

2.4 數據處理 每個數據平行3次實驗，數據用SpssStatisticsV 17.0進行統計學處理，結果以“均值±標準差”的形式表示。采用最小顯著差異法 (LSD)對不同組數據進行單因素方差分析，顯著性水平α取0.05。

3 結果與討論

3.1 咖啡因和兒茶素類的標準曲線 兒茶素類和咖啡因的標準曲線的回歸方程及相關系數見表3。

表3 線性回歸方程和相關系數

3.2 酸性白土吸附茶多酚中咖啡因的工藝優化

3.2.1 酸性白土用量對咖啡因吸附效果的影響 如圖1所示，當酸性白土用量為10、20、30 g/L時，咖啡因量依次顯著降低 (P＜0.05)。當酸性白土用量為30 g/L時，與40、50 g/L時相比，咖啡因量無顯著變化 (P＞0.05)，但茶多酚質量卻顯著減小 (P＜0.05)，故選30 g/L為適宜的酸性白土用量。

3.2.2 吸附時間對咖啡因吸附效果的影響 如圖2所示，當吸附時間為20、40 min時，咖啡因量依次顯著降低 (P＜0.05)。當吸附時間為40 min時，與60、80 min時相比，咖啡因量無顯著變化 (P＞0.05)，茶多酚質量卻顯著減小

圖1 酸性白土用量對咖啡因量和茶多酚質量的影響(P＜0.05)，故選40 min為適宜的吸附時間。

圖2 吸附時間對咖啡因量和茶多酚質量的影響

3.2.3 吸附次數對咖啡因吸附效果的影響 如圖3所示，當吸附次數為1、2和3次時，咖啡因量依次顯著降低(P＜0.05);當吸附次數為3次時，與4和5次相比，咖啡因量無顯著變化 (P＞0.05)，茶多酚質量卻顯著減小 (P＜0.05)，故選3次為適宜的吸附次數。

圖3 吸附次數對咖啡因量和茶多酚質量的影響

3.2.4 攪拌速率對咖啡因吸附效果的影響 如圖4所示，當攪拌速率為40、80、120 r/min時，咖啡因量依次顯著降低 (P＜0.05)。當攪拌速率為120 r/min時，與160、200 r/min時相比，咖啡因量無顯著變化 (P＞0.05)，茶多酚質量亦無顯著變化 (P＞0.05)。故選120 r/min為適宜的攪拌速率。

3.2.5 酸性白土吸附茶多酚中咖啡因的正交試驗 為了更好地分析各個因素對茶多酚提取液中咖啡因脫除效果的影響，按表2的設計進行正交試驗，以確定最經濟最有效的工藝方案。正交試驗結果見表4，方差分析結果見表5。

圖4 攪拌速率對咖啡因和茶多酚質量的影響

表4 吸附條件正交試驗結果

表5 正交試驗方差分析

由表4可知，4個因素對咖啡因量影響作用的大小順序為C＞A＞D＞B，即吸附次數＞酸性白土用量＞攪拌速率＞吸附時間，正交試驗優化的酸性白土吸附茶多酚中咖啡因的工藝條件為A3B2C3D3，即酸性白土用量40 g/L、吸附時間60 min、吸附次數3次和攪拌速率160 r/min。由表5可知，4個因素中只有吸附次數對咖啡因量影響顯著 (P＜0.05)。

單因素試驗得到的最佳工藝條件為A2B1C3D2，正交試驗得到的最佳工藝條件為A3B2C3D3，為驗證可選方案，以未吸附組為對照，作驗證實驗以比較這兩個方案的優劣。結果表明，對照組、單因素優化組和正交優化組對應的茶多酚質量分別為 (1.121±0.004)g、(1.058±0.002)g和(1.021±0.002)g，咖啡因質量分數分別為 (3.68±0.25)%、(0.06±0.01)%和 (0.04±0.01)%。單因素優化組或正交優化組與對照組相比，茶多酚質量和咖啡因量均顯著減小或降低 (P＜0.05)，正交優化組與單因素優化組相比，咖啡因量無顯著變化 (P＞0.05)，茶多酚質量卻顯著減小 (P＜0.05)。綜上，從經濟、簡便、省時和高效的角度考慮，優先選用單因素試驗得到的最佳工藝條件A2B1C3D2。

3.3 酸性白土吸附咖啡因對茶多酚中各組分的影響 未吸附組和吸附組對應的茶多酚的高效液相圖和咖啡因與兒茶素類的量分別如圖5和表6所示。

圖5 對照品 (A)和脫咖啡因茶多酚 (B)的高效液相色譜圖

表6 脫咖啡因前后茶多酚組分的變化

結果表明，酸性白土對茶多酚中咖啡因的脫除效果十分顯著，未吸附組茶多酚中咖啡因質量分數為 (3.68±0.25)%，而吸附組降為 (0.06±0.01)%，咖啡因脫除率達98.25%;未吸附組茶多酚中最主要的兒茶素類是表沒食子兒茶素沒食子酸酯，兒茶素類的量由高到低依次是表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯、沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素、沒食子酸和兒茶素。吸附組茶多酚中兒茶素類的量均有所提高，這是因為酸性白土吸附咖啡因后，咖啡因量的顯著降低引起了兒茶素類相對含有量的提高，其提高次序由高到低依次是兒茶素、表兒茶素、沒食子酸、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯和沒食子兒茶素沒食子酸酯，酯型兒茶素表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表兒茶素沒食子酸酯的質量分數分別提高了12.26%和8.23%;表沒食子兒茶素沒食子酸酯和沒食子兒茶素沒食子酸酯為同分異構體，未吸附組茶多酚中表沒食子兒茶素沒食子酸酯和沒食子兒茶素沒食子酸酯的量之比為2.28，吸附組茶多酚中表沒食子兒茶素沒食子酸酯和沒食子兒茶素沒食子酸酯的量之比為2.49，兩者之間無顯著差異 (P＞0.05)，說明酸性白土脫除茶多酚中的咖啡因后，表沒食子兒茶素沒食子酸酯和沒食子兒茶素沒食子酸酯之間沒有發生明顯的同分異構轉化。

王瑞芳等［10］研究表明，弱極性吸附樹脂RX-2對綠茶提取液中的咖啡因具有較高的吸附容量和吸附選擇性，動態吸附時發生層析分離，是一種較為理想的咖啡因脫除劑，經兩級樹脂純化后，咖啡因量降至0.2%以下。岳鵬翔等［11］對綠茶濃縮液中咖啡堿的超臨界CO2萃取工藝進行了研究，結果表明，超臨界CO2萃取技術能有效地脫除綠茶濃縮液中的大部分咖啡因，咖啡因脫除率為84.26%。王平等［12］探討了活性炭吸附脫除茶葉提取液中咖啡因的最佳工藝條件，結果表明，在最優條件下咖啡因質量分數降為0.18%。與上述脫除咖啡因的方法相比，該法具有更高的咖啡因脫除率 (98.25%)，咖啡因質量分數降為 (0.06±0.01)%，而且避免了有機溶劑殘留、設備投資高和工藝復雜等弊端。

4 結論

本實驗通過單因素及正交試驗對酸性白土吸附茶多酚中咖啡因的工藝進行了優化，結果顯示，酸性白土吸附茶多酚中咖啡因的最佳工藝條件為酸性白土用量30 g/L、吸附時間40 min、吸附次數3次和攪拌速率120 r/min，這幾個因素對咖啡因量影響作用的大小順序為吸附次數＞酸性白土用量＞攪拌速率＞吸附時間，且吸附次數對咖啡因量影響顯著 (P＜0.05)。此外，酸性白土吸附茶多酚中的咖啡因后，咖啡因量由 (3.68±0.25)%下降為 (0.06±0.01)%，咖啡因脫除率達98.25%，兒茶素類活性物質的量均有所提高，且表沒食子兒茶素沒食子酸酯和沒食子兒茶素沒食子酸酯之間未發生明顯的同分異構轉化。

綜上，酸性白土吸附法能夠有效地脫除茶多酚中的咖啡因，且與其它方法相比，茶多酚中咖啡因的脫除率更高，兒茶素類活性物質未有損失，且操作簡便，成本低廉，安全無毒，省時高效，有利于工業化生產，是一種值得推廣的方法。

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