HPLC法同時測定婦炎康片中丹酚酸B、隱丹參酮和芍藥苷

田 潤

(湖南中醫藥高等專科學校，湖南株洲412012)

婦炎康片是國家中藥保護品種，具有消炎止痛、活血化瘀、軟堅散結的功效，臨床用于治療痛經、陰道炎、盆腔炎等婦科炎癥［1］。丹參、赤芍為婦炎康片的主藥之一，藥理學證明，丹酚酸B有一定的抑制血管通透作用［2］、芍藥苷具有良好的抗炎作用［3］。本實驗采用HPLC法同時測定丹酚酸B，芍藥苷和隱丹參酮，為婦炎康片質量控制提供可靠、快速、準確的檢測方法。

1 儀器與試劑

Agilent1100高效液相色譜儀 (美國Agilent公司)(G1314型可變波長紫外檢測器);ODSC18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5μm)(Thermo);752N型紫外-可見分光光度計 (上海精密科學儀器有限公司);百萬分之一分析天平 (德國，sartorius MP2型);KQ-200VDE型超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)。丹酚酸 B對照品 (批號:111563-200608)，芍藥苷對照品 (批號:0763-200117)，隱丹參酮 (批號:854-994)對照品均購自中國藥品生物制品檢定所。乙腈 (色譜純，湖北杜克化學科技有限公司)。水為超純水，其他試劑均為分析純。婦炎康片 (自制)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 ODS C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5μm);流動相A為乙腈，流動相B為0.03 mol/L KH2PO4;柱溫30℃;檢測波長230、270 nm;體積流量1.0 mL/min;進樣量10μL。流動相梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相梯度洗脫順序Tab.1 Condition of gradient elution mode

2.2 測定溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取丹酚酸B、芍藥苷及隱丹參酮對照品適量，加甲醇制成丹酚酸B和芍藥苷質量濃度為0.100 0 mg/mL，隱丹參酮質量濃度為0.030 0 mg/mL的對照品混合溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取婦炎康片20片，研細，稱取細粉約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，精密稱定，然后超聲處理35 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，過濾，取續濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液制備 按處方比例分別制備不含丹參和赤芍藥的2種婦炎康片，按供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液。

2.3 系統適應性試驗 分別精密吸取供試品溶液、對照品溶液和陰性樣品溶液各10μL，在上述色譜條件下分析，色譜圖見圖1。丹酚酸B、隱丹參酮、芍藥苷的保留時間分別為29.813、34.879、15.328 min，理論塔板數按丹酚酸B峰、隱丹參酮峰、芍藥苷峰計算均不低于4 000。丹酚酸B、隱丹參酮、芍藥苷與其他雜質峰分離良好。

2.4 線性關系試驗 取對照品溶液分別進樣5、10、15、20、25μL，記錄色譜峰面積。以進樣量(質量濃度)為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。線線擬合得丹酚酸B的線性回歸方程Y=1 610.7X－0.635 1，r=0.999 8，線性范圍為0.502 0～2.510 0μg;芍藥苷的線性回歸方程為 Y=1.133×104X+1.658×103，r=0.999 7，線性范圍為0.471 0～2.350μg;隱丹參酮線性回歸方程為Y=5.286×105X+1.835×105，r=0.999 3，線性范圍為0.040 0～2.200μg。

2.5 精密度試驗 取同一對照品溶液，連續進樣6次，在相同條件下測定，得丹酚酸B，芍藥苷和隱丹參酮的色譜峰面積的RSD分別為0.14%、0.62%、0.83%(含有量的測定代入方程計算可得，下同)，結果表明精密度良好。

2.6 重復性試驗 取批號為2010608的樣品6份，按2.2.2項下方法制備供試品溶液6份，按2.1項色譜條件測定，測得樣品中丹酚酸B、隱丹參酮、芍藥苷峰面積的 RSD分別為0.49%、0.85%、1.03%，表明本方法重復性良好。

圖1 婦炎康片、對照品和陰性樣品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of Fuyankang Tablets，reference substances and negative samples

2.7 穩定性試驗 吸取同一供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、12 h按2.1項色譜條件測定，測得丹酚酸B、隱丹參酮、芍藥苷峰面積的RSD分別為1.32%、1.53%、1.67%，表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取6份已知丹酚酸B，芍藥苷和隱丹參酮量的樣品，分別加入一定量的丹酚酸B，芍藥苷和隱丹參酮，測定丹酚酸B，芍藥苷和隱丹參酮，計算回收率，結果見表2～表4。

表2 丹酚酸B加樣回收率試驗結果Tab.2 Recovery of salvianolic acid B in Fuyankang Tablets

表3 芍藥苷加樣回收率試驗結果Tab.3 Recovery of paeoniflorin in Fuyankang Tablets

表4 隱丹參酮加樣回收率試驗結果Tab.4 Recovery of cryptotanshinone in Fuyankang Tablets

2.9 樣品測定 從不同批次的婦炎康片中，各取6份適量，按2.2.2項下方法，制備供品溶液。按2.1項色譜條件測定，每批平行測定6份，結果見表5。

表5 丹酚酸B、芍藥苷和隱丹參酮測定結果(n=6)Tab.5 Contents of salvianolic acid B，paeoniflorin and cryptotanshinone in Fuyankang Tablets(n=6)

3 討論

3.1 取丹酚酸B、芍藥苷對照品溶液在752N型紫外-可見分光光度計上，于200～400 nm波長范圍內掃描。結果表明丹酚酸 B在230、280、310、330 nm有最大吸收，芍藥苷在230 nm處有最大吸收。故選擇230 nm為丹酚酸B、芍藥苷的測定波長。隱丹參酮的測定波長為270 nm動相。

3.2 根據丹酚酸 B對熱不穩定性化學性質［4-5］，故采用超聲波提取。對不同超聲時間 (25、35、45 min)丹酚酸B，芍藥苷提取率進行比較發現超聲提取35 min時丹酚酸B，芍藥苷質量濃度基本達到最大，隨超聲時間的增加其質量濃度不再增加。因此超聲提取時間選用35 min。根據對婦炎康片多批樣品的測定結果表明，超聲波提取率相對穩定。

3.3 針對婦炎康片十三味組成藥材主要化學成分的理化性質差異，分別選擇了超臨界二氧化碳萃取、75%乙醇和水加熱回流提取。丹參采用75%乙醇加熱回流提取，芍藥采用水加熱回流提取，發現產品中丹酚酸B、隱丹參酮及芍藥苷量均大于原膠囊劑型。

3.4 參照文獻 ［6-12］選用不同的流動相，發現在乙腈-0.03 mol/L磷酸二氫鉀為流動相，梯度洗脫過程，丹酚酸與芍藥苷的分離度好，且出峰時間合適故選此做為定量測定的流動相。

［1］劉雅茹，孟憲生，馮雪松．康婦炎膠囊的薄層色譜鑒別［J］．醫藥導報，2006，25(10):1053-1054．

［2］邱 彥，芮耀誠，張 黎，等．血管內皮生長因子對大鼠腦血管通透性的影響及丹酚酸B對其抑制作用［J］．解放軍藥學學報，2002，18(1):17．

［3］張詩平，周世文，湯建林，等．婦炎康復片藥效學實驗研究［J］．中成藥，2002，24(8):611．

［4］倪力軍，鄔科芳，張立國．加熱方式對丹酚酸物質的量的影響［J］．中藥新藥與臨床藥理，2006，17(1):55．

［5］李向軍，劉敏彥，趙興茹，等．丹參水溶性成分提取工藝研究［J］．中國中醫藥信息雜志，2005，12(1):49．

［6］陳小新，原 素，蔣東旭，等．HPLC法同時測定婦炎康灌腸劑中小檗堿和丹酚酸B的含量［J］．中藥新藥與臨床藥理，2008，19(5):393-396．

［8］張月輝，王冬梅，王安達，等．HPLC法同時測定益胃口服液中芍藥苷和橙皮苷的含量［J］．沈陽藥科大學學報，2007，24(8):495-499．

［9］何 洋，王冬梅，董振敏，等．HPLC法同時測定丹燈通腦膠囊中野黃芩苷和丹酚酸B的含量［J］．沈陽藥科大學學報，2007，24(8):491-495．

［10］賈善學，丁昌成，仲 浩，等．反相HPLC法測定婦炎康片中芍藥苷的含量［J］．山東中醫雜志，2001，20(12):747-750．

［11］汪選斌，湛曉明，王明仲，等．HPLC同時測定婦炎康復片3種主要抗炎成分含量［J］．鄖陽醫學院學報，2010，29(1):28-31．

［12］劉 蔚，宋衛中，宋景芳．HPLC法測定婦康炎片中芍藥苷的含量［J］．河南大學學報:醫學版，2006，25(4):51-53．