HPLC法同時(shí)測(cè)定胃復(fù)春片中藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素、藍(lán)萼丁素

蔣慧蓮， 祝 明， 陳 勇， 李文庭

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州310053;2.浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江杭州310004)

胃復(fù)春片具有健脾益氣、活血解毒之功效，其主要組成為紅參、香茶菜、枳殼［1］。臨床上胃復(fù)春片用于胃癌前期以及慢性胃炎的治療，胃復(fù)春片系純中藥制劑，長期使用安全可靠，毒副作用小，是治療慢性萎縮性胃炎比較理想的藥物［2-6］。香茶菜目前的標(biāo)準(zhǔn)多為地方標(biāo)準(zhǔn)，而各地的標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)香茶菜的基源規(guī)定差異較大。經(jīng)調(diào)研，目前市場上香茶菜實(shí)際流通與使用較多的為安徽及河南產(chǎn)的香茶菜，主要品種為藍(lán)萼香茶菜。藍(lán)萼香茶菜Rabdosia japonica(Burm．f．)Hara var．Glaucocalyx(Maxim．)Hara為唇形科植物，具有健胃消食、清熱解毒、活血等作用及抗菌、抗癌和抗腫瘤等生物活性［7-12］。藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素、藍(lán)萼丁素均為藍(lán)萼香茶菜的主要成分［13］，目前尚未有報(bào)道對(duì)胃復(fù)春片中香茶菜的相關(guān)成分進(jìn)行測(cè)定，而香茶菜作為胃復(fù)春片的主要成分，為了更好地對(duì)胃復(fù)春片的質(zhì)量進(jìn)行控制，作者對(duì)胃復(fù)春片中香茶菜主要成分藍(lán)萼甲素、乙素、丁素進(jìn)行測(cè)定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-20A高效液相色譜儀 (日本島津);METILER AE240型電子天平。

1.2 試劑與試藥 對(duì)照品:藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素及藍(lán)萼丁素均為自制，純度＞99%。樣品:胃復(fù)春片10批，杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。甲醇、乙腈均為色譜純;水為重蒸水;其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 kromasil C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5μm)，流動(dòng)相為乙腈 (A)-甲醇(B)-水 (C)梯度洗脫，0～18 min，24%A，5%B，71%C;18～45 min，24% ～10%A，5%～50%B，71% ～40%C;45 min～51 min，10%～80%A，50% ～5%B，40% ～15%C;51 min～53 min，80% ～24%A，5%B，5% ～71%C;53 min～60 min，24%A，5%B，71%C;體積流量1 mL/min;檢測(cè)波長232 nm;柱溫30℃;進(jìn)樣量10μL，標(biāo)準(zhǔn)曲線法。對(duì)照品及供試品色譜圖見圖1。

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素、藍(lán)萼丁素適量，加70%甲醇配置成質(zhì)量濃度為48.68、32.96、30.56μg/mL的對(duì)照品溶液。

圖1 胃復(fù)春片HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s of W eifuchun Tablets

2.3 供試品溶液的制備 取樣品 (批號(hào)1111247)適量，研細(xì)，取1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液25 mL，蒸干，加水15 mL溶解，用三氯甲烷振搖提取4次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，加甲醇溶解轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中并稀釋至刻度，搖勻即得。

2.4 測(cè)定方法 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算，即得。

2.5 線性關(guān)系考察 分別精密稱取藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素、藍(lán)萼丁素適量，加70%甲醇溶解并稀釋成質(zhì)量濃度為97.36、65.92、61.12μg/mL的混合對(duì)照溶液，精密量取0.5、1、2、3、5、10、15、20、25μL，注入液相色譜儀，以色譜峰峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量 (X，ng)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。結(jié)果表明藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素、藍(lán)萼丁素在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度內(nèi)線性關(guān)系良好。見表1。

表1 藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素、藍(lán)萼丁素的線性關(guān)系Tab.1 Linearity of glaucocalyxin A，glaucocalyxin B and glaucocalyxin D

2.6 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照溶液按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄對(duì)照品峰面積，藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素、藍(lán)萼丁素峰面積RSD分別為0.3%、0.3%、0.4%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取胃復(fù)春片供試品 (批號(hào)1111247)按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在0、2、4、8、12、18、24 h進(jìn)樣測(cè)量峰面積，結(jié)果藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素及藍(lán)萼丁素的峰面積RSD分別為1.2%、0.3%及0.1%，表明供試樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取胃復(fù)春片供試品 (批號(hào)1111247)，按2.3項(xiàng)下方法同時(shí)制備6份供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素、藍(lán)萼丁素的含有量RSD分別為1.2%、1.8%及1.8%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 專屬性試驗(yàn) 按胃復(fù)春片制備工藝及2.3項(xiàng)下供試品制備方法制備缺香茶菜的陰性樣品溶液，以2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素、藍(lán)萼丁素均未檢測(cè)出。見圖1。

2.10 加樣回收率 稱取已測(cè)定的供試品 (批號(hào)1111247)約0.5 g，共6份，分別加入適量藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素、藍(lán)萼丁素的混合對(duì)照品，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液。在2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10μL，計(jì)算加樣回收率。見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.2 Resu lts of recoveries(n=6)

2.11 樣品測(cè)定 取10批供試品，按2.3項(xiàng)下供試品制備方法制備供試液并測(cè)得藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素、藍(lán)萼丁素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.31～1.01 mg/g、0.26 ～1.14 mg/g、0.24 ～0.96 mg/g。見表3。

表3 胃復(fù)春片中藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素、藍(lán)萼丁素測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.3 Contents of glaucocalyxin A，glaucocalyxin B and glaucocalyxin D in Weifuchun Tablets(n=3)

3 討論

3.1 曾嘗試用70%甲醇、乙醇、70%乙醇進(jìn)行提取，結(jié)果效果均未有甲醇提取好，因此確定使用甲醇作為提取溶劑。超聲時(shí)間15 min、30 min、45 min以及60 min比較，結(jié)果15 min的時(shí)候未提取完全，而45 min和60 min的提取效果和30 min相近，因此選擇超聲30 min進(jìn)行提取。選擇萃取溶劑時(shí)，對(duì)乙酸乙酯、三氯甲烷以及乙醚做比較，結(jié)果乙酸乙酯萃取后雜質(zhì)較多，乙醚萃取效果較差，三氯甲烷萃取效果最佳，雜質(zhì)少，因此選用三氯甲烷作為萃取溶劑。

3.2 曾嘗試以乙腈-水、甲醇-水、乙腈-甲醇-水以一定比例進(jìn)行等度洗脫，結(jié)果雜質(zhì)干擾較嚴(yán)重，且未能將藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素以及藍(lán)萼丁素進(jìn)行較好分離，最后考慮使用乙腈-甲醇-水進(jìn)行梯度洗脫，將3個(gè)物質(zhì)進(jìn)行了較好分離。

3.3 曾將色譜條件中的色譜柱換成SB C18柱以及月旭C18柱進(jìn)行考察，體積流量也以0.9mL/min和1.1 mL/min的體積流量與本方法進(jìn)行了比較，柱溫考察了25℃以及40℃，結(jié)果表明藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素、藍(lán)萼丁素均能較好分離，而且不同色譜條件下含有量差異均在0.5%以內(nèi)，表明本方法耐用性良好。

3.4 從10批胃復(fù)春片測(cè)定結(jié)果看，樣品中均含有藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素、藍(lán)萼丁素，說明胃復(fù)春片現(xiàn)基本以藍(lán)萼香茶菜作香茶菜投料，從測(cè)定結(jié)果來看，不同批次樣品藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素、藍(lán)萼丁素的含有量差異較大，因此有必要對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制。而本方法對(duì)藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素、藍(lán)萼丁素進(jìn)行測(cè)定準(zhǔn)確度高，耐用性好，能作為控制胃復(fù)春片質(zhì)量的方法。

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