脈血康膠囊對高脂血癥大鼠脂質代謝及黏附分子表達的影響

高麗娟， 楊 喬， 王 崢， 胡耀紅

(1.天津醫科大學研究生院，天津300070;2.天津醫科大學總醫院中醫科，天津300052)

動脈粥樣硬化 (atherosclerosis)是一種慢性炎 癥反應性疾病［1］，盡管動脈粥樣硬化發生的因素是多方面的，但最終都導致動脈內膜損傷，而粥樣硬化病變的形成是動脈對內膜損傷做出的炎癥纖維增生性反應的結果［2］。高脂血癥是動脈粥樣硬化發生、發展的主要危險因素之一。在長期高脂狀態下，增高的脂蛋白尤其是氧化低密度脂蛋白 (oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)具有高度細胞毒性，易造成血管內皮細胞損傷［3］。目前研究發現，損傷的內皮細胞可誘導性表達多種黏附分子，如黏附分子-1(ICAM-1)等，黏附分子可介導白細胞與內皮細胞黏附，促進循環中白細胞遷移并聚集于動脈內膜［4-5］，參與動脈的炎癥過程，是動脈粥樣硬化形成的重要因素［6］。

脈血康膠囊為水蛭經適宜的加工制成的膠囊劑。水蛭為水蛭科動物螞蝗Whitmania pigra Whitman、水蛭 Hirudo nipponica Whitman或柳葉螞蝗Whitmania acranulata Whitman的干燥全體，具有破血逐瘀通經的功效。目前有關水蛭素的研究已有很多，天然水蛭素是從水蛭中提取的一種抗凝血蛋白質，具有抗凝、抗血栓等作用，是迄今為止世界上最強的凝血酶抑制劑，在治療各種血栓性疾病及彌散性血管內凝血中均有很好的預防及治療效果，由于它安全且沒有副作用，因而比肝素更有優越性。1986年，隨水蛭素的cDNA被克隆出來之后，重組水蛭素的研究取得了很大的進步。傳統中藥是干燥的水蛭全體入藥，對水蛭干燥全體的基礎研究甚少，對其作用機制更是未知。臨床觀察顯示脈血康膠囊對心腦血管疾病［7-8］、外周血管疾病有較好療效。本實驗通過觀察脈血康對高脂血癥大鼠脂質代謝、一氧化氮 (NO)水平及主動脈內皮細胞ICAM-1表達的影響，以探討脈血康預防動脈粥樣硬化形成的可能性及其作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物 健康雄性SD大鼠50只，平均體質量(180±20)g，購于中國醫學科學院放射研究所實驗動物中心，許可證號:SCXK(津)2010-0002。

1.2 藥物及主要試劑 脈血康膠囊為水蛭經適宜的加工制成的膠囊劑，本實驗所用藥物為脈血康膠囊內容物即水蛭粉 (批號:20110715)，由貴州信邦制藥股份有限公司提供;高脂飼料 (配方:82.7%普通飼料、2%膽固醇、0.3%膽鹽、5%蔗糖、10%豬油)和普通飼料由天津實驗動物中心飼料廠提供;血脂檢測試劑盒購自中生北控生物科技股份有限公司;血糖試劑盒購自保定長城臨床試劑有限公司;纖維蛋白原試劑盒購自天津美德太平洋科技有限公司;一氧化氮試劑盒購自南京建成生物工程研究所;大鼠細胞ICAM-1酶聯免疫檢測試劑盒購自美國R＆D公司。

1.3 主要儀器 D—320型全自動生化分析儀 (南京英諾華醫療科技公司)，TS—6000型半自動血凝儀 (天津美德太平洋科技有限公司)，TU—1810紫外可見分光光度計 (北京普析通用儀器有限責任公司)等。

2 實驗方法

2.1 分組及處理 適應喂養1周，將大鼠分為5組，即正常對照組，模型組，脈血康膠囊高、中、低 (3.0、1.5、0.3 g/kg)劑量組，每組各10只。除正常對照組外，其余各組均喂高脂飼料，次日按10 mL/kg開始灌胃給藥，正常對照組和模型組灌服等容積生理鹽水，每天1次，連續8周，并于每周稱體質量一次以調整給藥量。

2.2 觀察指標及方法

2.2.1 血清指標 分別于第4周和實驗末，各組動物禁食 (自由飲水)12 h，次日清晨取血3 mL，3 000 r/min離心15 min，取上層血清，于全自動生化儀上測血糖、血清總膽固醇 (TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇 (LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇 (HDL-C)水平，并根據公式AI=(TC－HDL-C)/HDL-C，計算AI。實驗末，同時取血清，用硝酸還原酶法測血清NO的水平，具體步驟均按試劑盒說明書進行。

2.2.2 血漿指標 實驗末，取血2 mL，3.2%枸櫞酸三鈉與全血按1∶9比例迅速混勻，離心取上層血漿，按試劑盒說明于半自動血凝儀上測血漿纖維蛋白原 (FIB)水平。

2.2.3 組織指標 頸椎脫臼處死動物后，剖開胸、腹腔，取胸主動脈，剝離外膜脂肪組織后于－80℃冰箱保存。取標本待復溫后，用預冷生理鹽水漂洗，去除血跡，濾紙拭干，稱質量，將血管浸入冷生理鹽水(生理鹽水質量為血管的9倍)，剪碎，在冰水浴中制成10%的組織勻漿，離心取上清液，按試劑盒說明用ELISA法檢測主動脈ICAM-1的表達。

2.3 統計學方法 采用SPSS 16.0統計軟件處理，計量資料以均數±標準差 (± s)表示，多組資料組間比較采用單因素方差分析:方差齊者用 LSD檢驗，方差不齊者用Tamhane's T2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 脈血康對高脂血癥大鼠體質量的影響 實驗初，各組大鼠體質量無差異，每周各組大鼠體質量均增加，自實驗第2周起，模型組大鼠體質量明顯高于正常對照組 (P＜0.05)，各治療組大鼠體質量低于模型組，但差異無統計學意義，見表1。

表1 大鼠體質量的動態變化 ( ± s，n=10)Tab.1 Dynam ic changes of body weight in rats( ± s，n=10)

表1 大鼠體質量的動態變化 ( ± s，n=10)Tab.1 Dynam ic changes of body weight in rats( ± s，n=10)

注:與正常對照組比較，☆P＜0.05。

組 別 劑量/(g·kg－1)體質量/g 0周 2周 4周 6周 8周正常對照組 － 177.9±13.9 261.8±24.5 320.8±33.6 368.2±38.6 369.1±42.4模型組 － 185.9±17.0 285.5±32.0☆ 357.4±45.7☆ 410.0±51.1☆ 436.7±62.1☆脈血康組 0.3 180.0±14.0 271.4±14.1 325.0±20.8 387.5±22.9 396.6±25.0脈血康組 1.5 179.4±22.6 278.8±22.2 347.0±35.3 404.8±44.5 420.1±51.8脈血康組 3.0 180.0±16.2 279.3±18.2 345.3±29.4 373.2±30.6 420.0±41.0

3.2 脈血康對高脂血癥大鼠血糖的影響 第4周時，各組大鼠血糖無差異。第8周時，模型組大鼠血糖明顯高于正常對照組 (P＜0.01)，各治療組大鼠血糖明顯低于模型組 (P＜0.01)，提示脈血康有降糖作用，見表2。

表2 大鼠血糖的動態變化( ± s，n=10)Tab.2 Dynam ic changes of b lood glucose in rats( ± s，n=10)

表2 大鼠血糖的動態變化( ± s，n=10)Tab.2 Dynam ic changes of b lood glucose in rats( ± s，n=10)

注:與正常對照組比較，☆☆P＜0.01;與模型組比較，※※P＜0.01。

組 別 劑量/(g·kg－1)血糖/(mmol·L －1)4周 8周正常對照組 － 3.78±0.30 4.08±0.52模型組 － 3.65±0.48 6.01±0.99☆☆脈血康組 0.3 4.57±1.15 4.53±0.49※※脈血康組 1.5 3.31±0.74 4.38±0.68※※脈血康組 3.0 4.39±0.98 4.75±0.81※※

3.3 脈血康對高脂血癥大鼠血脂的影響 第4周時，模型組大鼠血清TC、LDL-C水平較正常對照組明顯升高，HDL-C水平明顯降低 (P＜0.01)，提示高脂血癥造模成功;各治療組大鼠血清TC、LDL-C水平較模型組有降低趨勢，HDL-C有升高趨勢;各組大鼠血清TG水平無顯著差異。第8周時，模型組大鼠血清TG、TC、LDL-C水平均較正常對照組明顯升高，HDL-C水平明顯降低 (P＜0.05或 P＜0.01);各治療組大鼠血清TG、TC、LDL-C水平較模型組明顯降低，HDL-C水平明顯升高 (P＜0.05或P＜0.01)，提示脈血康有調脂作用，見表3。

3.4 脈血康對大鼠動脈粥樣硬化指數 (AI)的影響 模型組大鼠AI較正常對照組明顯升高 (P＜0.05)，各治療組大鼠 AI較模型組有降低趨勢，但差異無統計學意義，見表4。

表3 大鼠血脂的動態變化( ± s，n=10)Tab.3 Dynam ic changes of blood lipids in rats( ± s，n=10)

表3 大鼠血脂的動態變化( ± s，n=10)Tab.3 Dynam ic changes of blood lipids in rats( ± s，n=10)

注:與正常對照組比較，☆P＜0.05，☆☆P＜0.01;與模型組比較，※P＜0.05，※※P＜0.01。

組 別 時點 劑量/(g·kg－1) TC/(mmol·L－1) TG/(mmol·L－1)LDL-C/(mmol·L－1)HDL-C/(mmol·L－1)正常對照組 4周 －1.54±0.16 1.31±0.11 0.46±0.05 1.32±0.25 8周 － 1.65±0.25 1.27±0.24 0.57±0.08 1.18±0.25模型組 4周 － 3.05±0.94☆☆ 1.23±0.90 0.94±0.34☆☆ 0.96±0.25☆☆8周 － 3.34±0.04☆☆ 1.74±0.08☆ 1.20±0.29☆☆ 0.83±0.10☆☆脈血康組 4周 0.3 2.67±0.85 0.91±0.21 0.80±0.23 1.17±0.23 8周 0.3 2.63±0.96 1.30±0.32 0.91±0.36 0.91±0.22脈血康組 4周 1.5 2.62±0.59 0.96±0.25 0.82±0.20 1.19±0.20 8周 1.5 2.72±0.19 1.23±0.36※ 0.95±0.26 1.03±0.19※脈血康組 4周 3.0 2.60±0.72 1.02±0.22 0.78±0.25 1.20±0.18 8周 3.0 2.58±0.47※※ 1.53±0.30 0.94±0.18※※0.96±0.10

表4 大鼠動脈粥樣硬化指數的變化 ( ± s，n=10)Tab.4 Changes of AI in rats( ± s，n=10)

表4 大鼠動脈粥樣硬化指數的變化 ( ± s，n=10)Tab.4 Changes of AI in rats( ± s，n=10)

注:與正常對照組比較，☆P＜0.05。

組 別 劑量/(g·kg－1)AI正常對照組 －1.00±0.10模型組 － 1.84±0.34☆脈血康組 0.3 1.78±0.36脈血康組 1.5 1.61±0.33脈血康組3.0 1.69±0.27

3.5 脈血康對高脂血癥大鼠血清NO和血漿FIB的影響 模型組大鼠血清NO水平較正常對照組明顯降低 (P＜0.05)，各治療組大鼠血清NO水平較模型組明顯升高 (P＜0.05)。模型組大鼠血漿FIB水平較正常對照組有升高趨勢，各治療組大鼠血漿FIB水平較模型組有下降趨勢，但差異均無統計學意義，見表5。

3.6 脈血康對大鼠主動脈細胞間ICAM-1表達的影響 模型組大鼠ICAM-1的表達較正常對照組明顯增強 (P＜0.05)，各治療組大鼠ICAM-1的表達較模型組明顯減弱 (P＜0.05)，見表6。

表5 大鼠血清NO和血漿FIB的變化( ± s，n=10)Tab.5 Changes of NO and FIB in rats( ± s，n=10)

表5 大鼠血清NO和血漿FIB的變化( ± s，n=10)Tab.5 Changes of NO and FIB in rats( ± s，n=10)

注:與正常對照組比較，☆P＜0.05;與模型組比較，※P＜0.05。

分組 劑量/(g·kg－1)NO/(μmol·L－1)FIB/(mmol·L －1)正常對照組 － 54.75±26.09 2.74±0.28模型組 － 26.53±13.46☆ 3.25±0.82脈血康組 0.3 54.04±30.17※ 2.82±0.58脈血康組 1.5 58.00±25.75※ 2.84±0.15脈血康組 3.0 56.36±22.70※2.86±0.70

表6 大鼠主動脈中ICAM-1蛋白水平的變化( ± s，n=10)Tab.6 Changes of ICAM-1 protein contents in aortic wall in rats( ± s，n=10)

表6 大鼠主動脈中ICAM-1蛋白水平的變化( ± s，n=10)Tab.6 Changes of ICAM-1 protein contents in aortic wall in rats( ± s，n=10)

注:與正常對照組比較，☆P＜0.05;與模型組比較，※P＜0.05。

分組 劑量/(g·kg－1) ICAM-1/(ng·mL－1)正常對照組 －3.98±1.29模型組 － 5.58±0.48☆脈血康組 0.3 4.19±1.10※脈血康組 1.5 4.33±1.21※脈血康組 3.0 4.40±1.30※

4 討論

高脂血癥是動脈粥樣硬化發生和發展的主要危險因素之一。研究表明，血脂異常，尤其是TC、LDL-C升高與血管內皮功能紊亂獨立相關［9］。本研究采用高脂飼料造模后，大鼠血清 TC、TG、LDL-C升高，而HDL-C降低，呈現典型的脂質代謝紊亂狀態，說明大鼠高脂血癥模型建立成功。實驗結果表明脈血康可明顯降低血清TC、TG、LDLC水平，升高HDL-C水平，并降低動脈粥樣硬化指數 (AI)。提示脈血康膠囊可以糾正高脂狀態下脂質代謝紊亂，并通過調節脂質代謝，抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成。

NO是重要的病理生理因子，一氧化氮合酶(NOS)是NO合成過程的關鍵酶。NOS分為內皮型 (eNOS)、神經型 (nNOS)、誘生型 (iNOS)，前兩種又稱為結構型一氧化氮合酶 (cNOS)，主要存在于內皮細胞和神經細胞，cNOS活性只能維持幾秒到幾分鐘，由它催化生成的NO量較少，但具有廣泛的生理功能，如抑制血小板聚集、中性粒細胞黏附，調節微血管張力等，對機體具有保護作用［10］。iNOS主要存在于炎性細胞、血管平滑肌細胞、成纖維細胞等細胞中，在正常情況下不表達，當細胞受到炎性細胞因子或免疫微生物刺激時，iNOS將催化合成非生理濃度的大量NO，超過生理濃度的NO可與超氧陰離子(O－2)反應生成過氧化亞硝基陰離子 (ONOO－)，后者是強氧化劑，可造成脂質過氧化和內皮損傷，促進動脈粥樣硬化的發生發展。NO在心血管疾病中起保護作用還是有害作用與NOS的類型、NO產生的量及機體的氧化應激狀態有關［11］。有研究報道水蛭乙醇提取物具有降低NO水平的作用［12］，但在本實驗中，脈血康可升高NO水平。當內皮細胞受損時，內皮原來的eNOS活性降低，NO產生減少，此時水蛭粉升高NO水平，提示水蛭可通過保護血管內皮細胞功能升高NO水平，抑制動脈粥樣硬化的形成;當炎性細胞、血管平滑肌細胞、成纖維細胞等細胞受到炎性細胞因子或免疫微生物刺激時，iNOS表達及活性增加，誘導產生大量NO時，水蛭又可以通過抑制炎癥反應降低NO水平，抑制動脈粥樣硬化的形成。可見在不同的病理環境中，水蛭可通過糾正NO代謝紊亂，抑制動脈粥樣硬化的形成。

ICAM-1是存在于細胞表面的一種糖蛋白，其中以血管內皮細胞表面表達最強，正常情況下ICAM-1表達微弱甚至不表達，在動脈粥樣硬化初始形成過程中，血管內皮受損后，ICAM-1表達增加，高脂血癥時，血脂升高促進超氧陰離子產生，使低密度脂蛋白發生氧化修飾。研究表明，ox-LDL可以上調內皮細胞ICAM-1的表達，誘導單核細胞向血管內皮浸潤，單核細胞吞噬ox-LDL變為激活的巨噬細胞，最終成為充滿脂質的泡沫細胞［13］。本研究中，模型組ICAM-1的表達較正常對照組增強，脈血康治療組ICAM-1的表達較模型組減弱，提示脈血康可通過抑制ICAM-1的表達發揮抗動脈粥樣硬化的作用。

綜上所述，高脂狀態下血脂異常、血管內皮損傷是動脈粥樣硬化形成的重要環節，脈血康膠囊通過調節脂質代謝、糾正NO代謝紊亂、保護血管內皮功能及抑制ICAM-1的表達，干預動脈粥樣硬化的形成。此外，脈血康膠囊有明顯的降糖作用和一定的降纖維蛋白原作用。對于其調脂機制、降纖維蛋白原作用是否與促纖溶作用有關及降糖機制等問題，尚待進一步研究。

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