正交試驗優(yōu)化固本祛風(fēng)顆粒提取工藝＊

俞 冰，劉志承 ，李曙光 ，徐漢明，曹麗萍

(1.廣東省深圳市中醫(yī)院，廣東 深圳 518033; 2.廣東省深圳市寶安中醫(yī)院，廣東 深圳 518133)

固本祛風(fēng)湯是深圳市中醫(yī)院協(xié)定處方，由黃芪、徐長卿、蒼耳子、細(xì)辛、葶藶子、甘草等12味中藥組方，用于治療過敏性鼻炎，臨床應(yīng)用多年，安全有效[1]，但因口感差、使用不便，患者依從性較差，影響其臨床應(yīng)用。為此，改進(jìn)其劑型，研制了固本祛風(fēng)顆粒，并對其提取工藝進(jìn)行了研究。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

LC－20AT型高效液相色譜儀，ELSD－LTⅡ蒸發(fā)光散射檢測器，CTO－10AS vp柱溫箱(日本島津公司);Sartorius BP 211D型電子天平(十萬分之一，德國Sartorius公司);電熱恒溫套，CQ－250－DST型超聲波清洗儀(250 W/40 kHz，上海生析超聲儀器有限公司)。黃芪、徐長卿、蒼耳子、細(xì)辛、葶藶子、甘草等藥材(購自深圳市華輝藥業(yè)有限公司)，經(jīng)深圳市中醫(yī)院藥檢室檢驗，均符合藥典標(biāo)準(zhǔn);水為超純水，乙腈為色譜純(美國Tedia公司);黃芪甲苷對照品(批號為110781－200512，中國藥品生物制品檢定所)。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芪甲苷含量測定

2.1.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱:GL Inertsil ODS－SP 柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈(A)－水(B)，梯度洗脫，0～12 min，A ∶B=30∶70，12～30 min，A ∶B=32∶68;流速:1 mL/min;柱溫:28℃;氮氣壓力:360 kPa;蒸發(fā)溫度:40℃。理論板數(shù)以黃芪甲苷峰計算不低于10 000。在此條件下，色譜圖見圖1。

2.1.2 溶液制備

精密稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇配制成質(zhì)量濃度為0.52 g/L的對照品溶液。藥材加水，按工藝提取，濃縮至100 mL，為貯備藥液;精密量取貯備藥液20 mL，加水飽和的正丁醇溶液振搖提取4次，每次40 mL，合并正丁醇層，用氨試液洗滌2次，每次40 mL，棄去氨試液，正丁醇層水浴濃縮至干，殘渣加水10 mL，微熱使溶解，通過D－101型大孔吸附樹脂柱(12 cm×1.5 cm)，以水50 mL洗脫，棄去水液，再以30%乙醇30 mL洗脫，棄去洗脫液，繼以70%乙醇80 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶，加甲醇至刻度，搖勻，溶液過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。取不含黃芪的方中其他藥材，按供試品溶液制備方法操作，制得陰性對照品溶液。

圖1 高效液相色譜圖

2.1.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:取對照品溶液，分別精密進(jìn)樣 2，5，7，10，15，20 μL，按擬訂的色譜條件測定峰面積，以進(jìn)樣量的自然對數(shù)為橫坐標(biāo)、峰面積積分值的自然對數(shù)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=1.71X+11.301 5，r=0.999 8(n=6)。結(jié)果表明，黃芪甲苷進(jìn)樣量線性范圍是 1.04 ～10.4 μg。

精密度試驗:取同一對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，測定峰面積。結(jié)果黃芪甲苷含量的RSD為1.26%(n=6)。

穩(wěn)定性試驗:取同一供試品溶液，按擬訂的色譜條件分別于0，2，4，6，8，12 h 時進(jìn)樣測定。結(jié)果含量的RSD為 1.31%(n=6)。

重復(fù)性試驗:取同一貯備藥液5份，分別依法制備供試品溶液并測定含量。結(jié)果貯備藥液中黃芪甲苷平均含量為0.101 0 g/L，RSD為 1.58%(n=5)。

加樣回收試驗:精密取已知含量的貯備藥液共9份，每份10mL，分別精密加含黃芪甲苷0.52 g/L的對照品溶液1，2，3 mL各3份，按供試品溶液制備方法操作，依法測定峰面積。結(jié)果見表1。

表1 黃芪甲苷加樣回收試驗結(jié)果(n=9)

2.2 干膏得率測定

將藥液濃縮至100 mL，精密量取25 mL，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿，濃縮至干，于105℃干燥至恒重，得干膏，按干膏質(zhì)量與原藥材質(zhì)量的比值，求得干膏得率。

2.3 正交試驗

以加水量(因素A)、提取次數(shù)(因素B)、提取時間(因素C)為考察因素進(jìn)行正交試驗，每個因素設(shè)3個水平，選用L9(34)正交表進(jìn)行試驗。結(jié)果見表2至表4。直觀分析表明，各因素對提取效果的影響大小依次為提取次數(shù)、加水量、提取時間，最佳組合為C3A3B3;方差分析結(jié)果表明，因素C為顯著因素，因素A、因素B為非顯著因素。因此，確定最優(yōu)提取工藝為C3A1B1，即每次加8倍量水煎煮1 h，提取3次。

表2 正交試驗因素水平表

2.4 驗證試驗

取處方量藥材3份，按C3A1B1提取工藝，即每次加8倍量水煎煮1 h，共提取3次。濾過，合并濾液，減壓濃縮至100 mL，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件測定黃芪甲苷含量。結(jié)果貯備藥液中黃芪甲苷含量分別為0.101 6，0.101 0，0.100 2 g/L，平均 0.100 9 g/L;按 2.2 項下方法測得的干膏得率分別為 22.1% ，22.3% ，22.3% ，平均 22.2% 。結(jié)果表明，按C3A1B1提取工藝，黃芪甲苷含量和出膏率均基本達(dá)到最大值，說明工藝合理可行。

3 討論

黃芪是方中君藥，具有補(bǔ)氣升陽、益衛(wèi)固表、利水消腫等功效，具有改善心功能、促進(jìn)代謝、增強(qiáng)機(jī)體免疫、提高應(yīng)激能力等作用[2]。黃芪的提取方法有超濾法、回流法、煎煮法等[3]，黃芪甲苷含量測定有高效液相色譜－紫外法(HPLC－UV)[4]、高效液相色譜－蒸光散射檢測(HPLC－ELSD)法[5]、薄層掃描等方法。因HPLC－UV法對紫外末端吸收的物質(zhì)靈敏度差，薄層掃描法操作煩瑣、重復(fù)性差，而HPLC－ELSD法操作簡單、快捷、靈敏度高，故選用HPLC－ELSD法。黃芪含黃芪皂苷和黃芪多糖等有效成分，采用水提或醇提時黃芪甲苷提取量無顯著性差異，提取率能達(dá)到90% 以上[6]，而水提成本低廉，且黃芪多糖等成分水溶性較好，故采用水提工藝。選擇黃芪甲苷和干膏得率為指標(biāo)，可較好地保證制劑質(zhì)量。

表3 正交試驗及結(jié)果

表4 方差分析表

本研究結(jié)果準(zhǔn)確，工藝合理可行，為固本祛風(fēng)顆粒的研制和生產(chǎn)提供了研究資料。

[1]李 浩，李許娜，劉元獻(xiàn)，等.固本祛風(fēng)湯對變應(yīng)性鼻炎豚鼠模型組織病理學(xué)的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2008(15):20－21.

[2]劉玉蓮，楊叢忠.黃芪藥理作用概述[J].中國藥業(yè)，2004，13(10):79.

[3]馮祚臻，俸小平，官東秀.黃芪甲苷的提取及含量測定研究進(jìn)展[J].中國藥業(yè)，2005，14(11):80 －82.

[4]蔡進(jìn)章，王增壽，章曉東.反相高效液相色譜法測定黃芪中黃芪甲苷的含量[J].中國藥業(yè)，2003，12(12):36 －37.

[5]龐興壽，牟 曉.高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測器法測定仙芪眩寧顆粒中黃芪甲苷含量[J].中國藥業(yè)，2011，20(17):32－33.

[6]魏 敏，江雪華.正交設(shè)計法優(yōu)選黃芪提取工藝研究[J].基層中藥雜志，2000，14(6):23 －25.