濁點萃取法提取青蒿中青蒿素的工藝研究

況 剛 ，楊 林 ，鄭小平 ，何 丹

(1.重慶市食品藥品檢驗所，重慶 410021; 2.重慶醫科大學藥學院，重慶 400016)

青蒿Artemisia annuaL.是菊科1年生草本植物，是唯一含青蒿素的蒿屬植物，又名黃花蒿，為重慶道地藥材，主要藥效成分青蒿素(artemisinin)是非常有效的瘧疾治療藥物[1]。青蒿素的傳統提取生產工藝主要有有機溶劑萃取、超亞臨界流體萃取、微波萃取等方法[2]，但都存在提取率有限、雜質多、能耗高、試劑回收率低、資源嚴重浪費等不足。因此，尋找一種高效、低毒、穩定、適合工業化的青蒿素提取工藝對于重慶道地藥材的利用開發尤為重要。本研究中采用濁點萃取技術提取青蒿中的青蒿素，以正交試驗優化提取工藝，為青蒿素的高效、環保提取提供新方法。

1 儀器與試藥

UV 240型紫外分光光度計(日本島津公司);Model 800型超速離心機(上海優浦科學儀器有限公司);KQ2200B型超聲波清洗器(昆山市超聲洗器有限公司);電子恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠)。青蒿素對照品(批號為100202－201004，中國食品藥品檢定研究院);青蒿藥材采集于重慶各青蒿種植區縣，由重慶市食品藥品檢驗所中藥室鄭小平主管中藥師鑒定為菊科植物黃花蒿Artemisia annuaL.干燥地上部分;其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 青蒿的提取

將青蒿粉末干燥，過60目，取約10.0 g，精密稱定。向其中加入20 mL Genapol－X 80(10%)，磁力攪拌混合均勻，300 W超聲處理40 min后，4 000 r/min離心15 min，取上清液，加入適量鹽溶液，再次混合均勻，60℃恒溫水浴30 min，再4 000 r/min離心15 min，至溶液清晰地分為兩層，上層為表面活性劑富集相，下層為水相。分液漏斗中分離去水相，上層表面活性層中加入2 mL甲醇，以降低黏度，用超濾膜過濾，回收表面活性劑，濾液旋干，得青蒿提取物。

2.2 青蒿素的含量測定[3]

2.2.1 溶液制備

精密稱取濁點萃取得到的青蒿提取物0.88 g，溶解至25 mL容量瓶中，加入 0.2%NaOH溶液7 mL，于(50±1)℃水浴加熱 30 min，進行衍生，取出，冷水快速冷卻，0.22 μm 纖維素濾膜濾過，得供試品溶液。精密稱取青蒿素對照品50.0 mg，無水乙醇溶解，50 mL容量瓶定容，得質量濃度為1 g/L的對照品溶液。

2.2.2 方法學考察

標準曲線繪制:精密吸取對照品溶液 1，2，3，4，5 mL，置 25 mL容量瓶中，按供試品溶液同法處理，以無水乙醇為空白，在292 nm波長處測定吸光度值，以吸光度(A)為縱坐標、質量濃度(C)為橫坐標繪制回歸曲線，回歸方程為A=0.015 30C+0.001 6，r=0.999 6(n=5)。結果表明，青蒿素質量濃度在 0.04 ～0.2 g/L 范圍內與吸光度線性關系良好。

精密度試驗:取同一對照品溶液，依法在292 nm波長處測定吸光度。結果平均吸光度為 0.168，RSD為 0.56%(n=5)，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗:取同一供試品溶液，于12 h內隔1 h測定1次吸光度。結果平均吸光度為 0.165，RSD為 1.1%(n=5)，表明供試品溶液在12 h內基本穩定。

重復性試驗:取青蒿提取物，依法制備供試品溶液并測定吸光度。結果青蒿素平均含量為15.34 mg/g，RSD為0.72%(n=5)，表明方法重復性好。

回收率試驗:取已知含量的青蒿提取物，加入適量青蒿素對照品，按供試品溶液制備方法制備待測溶液，依法測定吸光度，計算回收率。結果平均回收率為100.3%，RSD為1.45%(n=5)，表明方法回收率較好。

2.2.3 樣品含量測定

以無水乙醇作為空白參比，取青蒿提取物，依法制備供試品溶液，在292 nm波長處測定吸光度，計算含量。

2.3 提取工藝條件的優化

采用正交試驗，以液固比(因素A)、平衡時間(因素B)、鹽溶液離子強度(因素C)、聚氧乙烯脂肪醇醚(Genapol－X 80濃度，因素D)為考察因素，每因素取3水平，選用L9(34)正交表進行試驗。因素水平見表1，結果見表2。可見，在影響濁點萃取法提取青蒿素的4個因素中，影響的大小次序為液固比、Genapol－X 80濃度、離子強度、平衡時間。各因素的優化工藝參數為A2B3C1D2，即液固比為 100∶1，平衡時間為 40 min，離子強度為 2.0 mol/L，Genapol－X 80濃度為 15.0%。此時青蒿素提取率最高，為15.33%。

2.4 最佳工藝驗證試驗

按優選的最佳工藝進行3次平行試驗，結果青蒿素平均提取率為15.32 mg/g，RSD為1.1%(n=3)，表明該工藝合理可行。

3 討論

濁點萃取技術(cloud point extraction，CPE)以水代替有機溶劑作為萃取劑，通過加入少量表面活性劑產生濁點現象，從而實現高效提取[4]。其原理是，表面活性劑結構上的親水基團與疏水基團分別與水和待提取的有效成分結合，形成疏水基團在內、親水基團在外的膠束，從而顯著提高水溶性不佳的有機物水提時的溶解度[5];同時，表面活性劑水溶液加熱到一定溫度(濁點溫度)后，溶液變渾濁并出現分相，通過改變試驗參數(如溶液的離子強度、溫度等)引發相分離，最終實現溶質的高效富集和分離[6－7]。

表1 濁點萃取的因素水平表

表2 濁點萃取條件的正交試驗結果

用濁點萃取法提取青蒿中青蒿素，具有操作簡單、綠色環保、避免高溫破壞和提取率高等優點，試驗中優化了液固比、平衡時間、鹽溶液離子強度、表面活性劑濃度等影響萃取效率的各種因素，得到最佳工藝，為青蒿素的提取提供了一種新的方法。

[1]謝德玉，葉和春.青蒿素的研究進展——生物技術的應用前景[J].植物學報，1995，12(4):28－31.

[2]李子穎，李士雨，齊向娟.青蒿素提取技術研究進展[J].中藥研究與信息，2002，2(4):17 －20.

[3]左巨波，代廣會，楊俊卿，等.現場快速檢測青蒿藥材質量的方法研究[J].重慶醫科大學學報，2009，34(2):206 －209.

[4]申進朝，邵學廣.濁點萃取技術及其在有機化合物分離分析中的應用[J].化學進展，2006，18(4):482.

[5]王志龍.非離子表面活性劑為溶媒的濁點萃取技術[J].化學工程，2006，34(4):9.

[6]J Zhou，SW Wang，LX Sun.Determination of Osthole in rat plasma by high－ performance liquid chromatograph using cloud－point extraction[J].Anal Chim Acta，2008，608(2):158.

[7]J Zhou.LX，Sun，SW Wang.Micelle －mediated extraction and cloud －point preconcentration of Osthole and imperatorin from Cnidium monnieri[J].J Chromatogr A，2008，1200(2):93.