小劑量地塞米松對膿毒癥大鼠金屬基質蛋白酶9等炎癥因子的影響

陳 昊 喬麗旻 周 超▲

1.上海市浦東新區周浦醫院呼吸內科，上海 201318；2.聯洋社區衛生服務中心內科，上海 200135

雖然目前對于皮質類固醇激素的臨床使用尚有爭議，2008拯救敗血癥患者運動（SSC）指南仍建議膿毒癥休克持續低血壓的情況下，若使用液體復蘇以及升壓藥物無效時使用皮質類固醇激素[1]。地塞米松（Dexamethasone，DEX）作為臨床上常用的皮質酮激素（glucocorticoid，GC），在臨床上已進行廣泛的應用。并有大量的文獻表明小劑量的使用激素可以對膿毒癥預后有一定改善[2-3]。本研究擬通過盲腸結扎穿刺（CLP）手術建立膿毒癥大鼠模型后進行地塞米松干預，來研究、觀察地塞米松對金屬基質蛋白酶-9（MMP-9）和腫瘤環死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）的影響及對生存率的作用。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

SD大鼠78只，體重235～260 g，SPF級大鼠，實驗大鼠均購自第二軍學動物實驗中心。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及常規處理

78只SD大鼠完全隨機分為CLP手術組、地塞米松治療組（DEX），每組各 36只，組內分 12 h組（共 6只）、24 h組（共 10只）、48 h組（共 10只）、96 h組（共 10只）。各組分別在預定時間點處死存活的大鼠。DEX治療組在手術完成后6 h皮下注射0.1 mg/mL的DEX。假手術組（sham）共6只，打開腹腔后僅翻動腸道即關腹，不予手術處理。

1.2.2 建立重癥膿毒癥動物模型

1.2.2.1 購入動物后進行適應飼養1周，開始實驗前禁食12 h。按照40 mg/kg劑量腹腔注射戊巴比妥。注射麻醉后，將動物置于仰臥位固定于操作板上，腹部手術區去毛后消毒后腹壁作長2 cm切口，切口進腹在分離回盲瓣末端并結扎盲腸，以針頭在結扎端處穿刺3次后擠出糞便，最后間斷縫合關腹，并在皮下注射生理鹽水100 mL/kg抗休克。實驗各分組在預定12、24、48 h時間點處死大鼠，處死后實驗對象并取標本。假手術組僅開腹翻動腸道后縫合，不予手術處理。術后不予生理鹽水補液。假手術組建立10 min后立即予處死。

1.2.2.2 DEX治療組在手術完成后6 h皮下注射0.1 mg/mL的DEX。CLP組不進行任何干預治療。

1.3 評價指標測定

1.3.1 生存率

記錄各實驗時間點大鼠的生存數目。

1.3.2 采集標本

1.3.2.1 采集血清標本：處死大鼠并取血置于離心管中，使用低溫離心機離心 30 min（2000 r／min），離心半徑 13.5 cm，取血清后立即凍存于-80℃冰箱中，待測定。

1.3.2.2 肺組織取材：處死實驗動物后開胸取肺，吸水紙吸取左肺表面液體，電子天平稱重后立即置于恒定90℃烤箱中烘干72 h后稱取干重，計算肺組織干/濕重比（W/D）。

1.3.3 血清炎癥因子的測定

采取雙抗體夾心ELISA法檢測血清炎癥因子MMP-9及 TNF-α、IL-6、白介素-8（IL-8）測定，試劑盒均購自上海西塘公司。嚴格按照試劑盒說明操作。

1.4 統計學方法

采用統計軟件SPSS 17.0對實驗數據進行分析，計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數資料以率表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗動物生存率記錄結果

地塞米松干預96 h后大鼠生存率有所改善，各組生存率見表1。經χ2檢驗24、48 h組生存率差異均無統計學意義（P ＞ 0.05）。

表1 實驗大鼠生存率情況

2.2 實驗動物W/D結果

CLP組的W/D水平在12 h出現下降，24 h組W/D水平仍進一步下降。48 h W/D水平開始上升。而在DEX組W/D水平同CLP變化類似，12 h組DEX干預后W/D低于CLP組（P＜0.05）。DEX干預組24 h組和48 h均高于CLP組。見表2。

2.3 實驗動物 TNF-α、IL-8、IL-6、MMP-9 血清水平表達結果

2.3.1 TNF-α

CLP術后TNF-α水平出現明顯上升，DEX組除12 h組外與同時間點CLP組比較均出現下降，但差異無統計學差異（P ＞ 0.05）。 見表2。

2.3.2 IL-8

DEX組比CLP組同時間點有下降趨勢，DEX干預后除12 h外各時間點與對照組比較均出現下降。48 h與對照組比較顯著下降，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。見表2。

表2 TNF-α、MMP-9、IL-6、IL-8、W/D 結果比較（±s）

表2 TNF-α、MMP-9、IL-6、IL-8、W/D 結果比較（±s）

注：與 CLP組同時間段比較，*P＜0.05；與 sham 組同時間段比較，#P＜0.05，##P＜0.01；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；MMP-9：金屬基質蛋白酶 9；IL-6：白介素-6；IL-8：白介素-8；W/D：肺組織干/濕重比；Sham：假手術組；DEX：地塞米松；CLP：盲腸結扎穿刺；“-”代表無數據

8.59±7.21 71.65±37.79 89.06±33.85 109.93±10.99-79.18±15.44 74.62±18.55 102.62±22.71 107.94±61.11 21.00±5.11 59.35±19.43 85.28±4.87 117.79±44.16-62.63±37.70 42.04±15.21#33.08±15.72##42.22±11.05 TNF-α（ng/L） IL-6（ng/L）150.15±43.99 1665.12±256.45 2201.55±147.39 3582.41±2304.93-2108.11±745.38 2033.23±220.48 1576.75±534.40##2115.82±604.54 IL-8（ng/L）12.15±5.66 12.47±2.50 23.47±11.62 45.27±21.38-12.39±11.71 15.67±1.20 16.57±5.56##20.99±2.51 4.87±0.13 4.63±0.11 4.40±0.14 4.49±0.10-4.41±0.02*4.48±0.07 4.53±0.19 4.58±0.04 MMP9（ng/L） W/D sham組CLP組12 h組24 h組48 h組96 h組DEX組12 h組24 h組48 h組96 h組6 6630 6973組別 只數

2.3.3 IL-6

DEX組比CLP同時間點比較有下降趨勢，DEX干預后除12 h外各時間點與對照組比較均出現下降。24 h與對照組比較顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05），48 h與對照組比較顯著下降，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。見表2。

2.3.4 MMP-9

DEX組比CLP組同時間點有下降趨勢，DEX干預后除12 h外各時間點與對照組比較均出現下降。48 h與對照組比較顯著下降，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。見表2。

3 討論

膿毒癥目前已成為住院患者最主要的死亡原因之一[4]。地塞米松對炎癥及免疫反應有強大的抑制效應，正確使用可以有效地改善膿毒癥的預后。不同的用藥劑量以及時間對于激素使用的療效均有明顯的影響[5-6]。綜合既往的文獻報道，本實驗選擇在CLP手術后6 h皮下使用小劑量的地塞米松。敗血癥早期應用糖皮質激素，可以激活免疫細胞，防止中性粒細胞活化及內皮細胞損害，減少花生四烯酸的釋放，抑制炎癥因子抗休克。減少前列腺素、氧自由基等炎癥介質的釋放，在膿毒癥時起到保護臟器功能的作用。本實驗結果，膿毒癥大鼠的生存率出現了明顯改善，僅有DEX組96 h仍有生存。而在24 h及48 h雖未有統計學差異，可能是僅是樣本量較少的原因。使用地塞米松后大鼠一般情況也有明顯改善，大鼠的進食量以及現活動較多，發熱，寒戰，豎毛情況均有改善。本實驗證實了在膿毒癥發生早期使用小劑量的地塞米松可以有效的改善膿毒癥的預后。

肺損傷過度的內源性炎癥介質的釋放是膿毒癥發生的最重要的原因[7-8]。大量炎癥因子參與了膿毒癥的過程[9-11]，炎癥因子參與了逐次炎性級鏈反應，最終加速了膿毒癥的進程。本次實驗中發現使用地塞米松干預后，所檢測的炎癥因子表達水平最終均出現下降。但同時發現地塞米松干預后早期炎癥因子水平下降尚不明顯，24 h組出現了明顯的下降。根據本實驗中地塞米松對于炎癥因子水平表現出廣泛的抑制作用，以及使用地塞米松后大鼠生存率和一般情況的改善，筆者考慮地塞米松可能通過下調炎癥介質水平水平對減輕膿毒癥的損傷。

TNF-α，被認為是膿毒癥病理過程中最重要的炎癥因子，是炎癥刺激下早期的始動炎癥因子。IL6在TNF之后升高，IL-6水平可以作為疾病嚴重程度及死亡率的預測[12]。在本實驗中地塞米松明顯下調TNF-α及IL-6，對于IL-6水平調控較為明顯。

MMP-9是金屬蛋白酶家族中分子質量最大的酶，又稱明膠酶B。MMP-9參與細胞外基質的破壞和改建。對于膠原和明膠以及纖維連接蛋白，層黏連蛋白等的降解均起到重要作用。當炎癥細胞被激活，炎癥因子大量釋放，從而最后促進MMP-9的高水平表達。MMP-9在組織重塑、傷口愈合、炎癥免疫等病理生理過程中均有重要作用[13]。目前有文獻表明MMP-9可能能作為炎癥的早期檢測指標[14]，并能作為一個預示炎癥的發生的標志物[15]。

膿毒癥發生后炎癥因子的釋放可以被初步分為兩階段：膿毒癥發生后炎癥因子被激活釋放，炎癥因子在促進全身炎癥的同時，也活化了中性白細胞彈性蛋白酶（NE）和金屬基質蛋白酶（MMPs）[16]。在試驗中筆者觀察到地塞米松干預后12 h炎癥介質水平尚無明顯變化，24 h和48 h出現明顯下降，故考慮地塞米松在重度膿毒癥發生后可能對晚期炎癥介質的效果更為明顯。

MMP-9及IL-8均為膿毒癥晚期炎癥因子。已有報道表明MMP-9在膿毒癥開始后裂解活化IL-8[17]。同時IL-8作為一個中性粒細胞趨化因子，而中性粒細胞在活化后又能釋放MMP-9。IL-8同MMP-9可能在膿毒癥過程中已形成正反饋。MMP-9對于IL-8有很強的趨化作用[18]。本實驗中在地塞米松的干預下MMP-9及IL-8水平均出現了明顯下降，地塞米松調控晚期炎癥因子的作用可能能有效改善膿毒癥的預后。

MMP-9對于細胞外基質及基底膜親和力高，大量釋放時破壞上皮的完整性破壞，可使蛋白質以及體液漏出。引起肺水增多，提高肺干濕重比。但在本實驗中未出現MMP-9同W/D的同步變化。筆者考慮在重度CLP手術后，嚴重膿毒癥下血管內皮細胞完整性遭破壞引起血漿外滲，但實驗中大鼠停止進食飲水導致大鼠處于嚴重的休克狀態，對照DEX干預組大鼠一般狀態較好飲水較多休克狀態得到一定程度改善。MMP-9破壞基底膜后由于體液量不足，故未出現明顯的肺水腫。

綜上所述，膿毒癥早期小劑量使用地塞米松可以有效的改善膿毒癥的預后。地塞米松通過抑制炎癥因子改善膿毒癥預后，地塞米松對于膿毒癥晚期炎癥因子水平MMP-9及IL-8的調控較TNF-α等早期炎癥因子可能更為重要。這可能對于激素干預治療提供新的研究方向。但尚需進行進一步的實驗增加樣本數來證實地塞米松對于生存率的改善。

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