硫化氫抑制前列腺癌骨轉移P C-3細胞增殖和侵襲的體外研究

黃新宇 楊遠良 許國華 容錫滄 馮瑞強

1.廣東省江門市人民醫院骨科，廣東江門 529000；2.廣州市番禺區中心醫院骨一科，廣東廣州 511400

前列腺癌發病率居美國男性惡性腫瘤中第一位[1]，每年因前列腺癌死亡的患者數僅次于肺癌居第二位，其發病率在我國也呈逐年升高趨勢。前列腺癌最易發生骨轉移，85%～100%死于前列腺癌的患者中合并骨轉移[2]。發生骨轉移后臨床上缺乏有效的治療手段，其確切轉移機制目前也不十分清楚[3-4]。因此，探尋新的治療前列腺癌骨轉移的方式及藥物很有必要。硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）是一種能溶于水有臭雞蛋氣味的氣體，作為一種氣體信號分子受到越來越廣泛的研究[5]。在哺乳動物、魚類乃至無脊椎動物體內，都可以生成內源性H2S氣體，發揮類似神經遞質的中樞調節作用。H2S發揮生物學效應的重要機制是調節細胞的增殖和凋亡[6-7]，Li等[8]報道硫化氫促進惡性膠質瘤的生長，Cao等[9]報道硫化氫導致胰腺腺癌細胞凋亡。目前的研究發現，釋放硫化氫的非甾體抗炎藥提高其對前列腺癌細胞的抗癌作用[10]，但機制還不太明確。本試驗以硫氫化鈉（sodium hydrosulfide，NaHS）作為硫化氫的供體，探討硫化氫對前列腺癌骨轉移PC-3細胞生長、侵襲的影響，并初步探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 試劑

NaHS購自Sigma公司；cck-8購自同仁公司；胎牛血清購自Gibco公司；抗 Bcl-2、抗 Bax和 Western-Blot檢測試劑盒購自Cell Signaling Technology Inc。細胞蛋白提取試劑盒購自碧云天生物技術有限公司。

1.2 細胞培養

前列腺癌細胞系PC-3購自ATCC，細胞置于含10%胎牛血清F-12培養基中，于37℃、5%CO2條件培養，取對數生長期細胞進行試驗。

1.3 細胞存活率的檢測

根據 NaHS濃度將實驗分為 0、1、2、4 mmol/L四組，每組均作用PC-3細胞36 h，檢測不同濃度下細胞存活率。取對數生長期細胞，以10 000個/孔接種于96孔板，37℃、5%CO2條件下培養過夜待細胞貼壁，用含有不同處理因素的培養基培養細胞，每組設5個復孔。處理結束后加入CCK-8（每孔 100 μL 加 10 μL CCK-8），輕搖，37℃孵育 4 h，然后用酶聯免疫檢測儀測定每孔在450 nm波長處的吸光度（OD）。取5孔OD值的平均值，按公式計算各組細胞存活率，存活率（%）=（實驗組 OD-空白對照組 OD）/（正常對照組OD-空白對照組OD）×100%，實驗重復3次，以0 mmol/L NaHS組為對照組，存活率為100%。

1.4 Transwell侵襲實驗

用0、1、2、4mmol/L NaHS分別作用PC-3細胞36h后，在具有8 μm小孔聚碳酸酯濾膜的培養小室上鋪用預冷無血清F-12培養基稀釋的Matrigel基質膠，接種100 μL無血清培養基稀釋的 PC-3細胞（5×105個/mL），下室加入600 μL含10%血清的F-12培養液，每組設6個復孔。37℃、5%CO2條件下培養24 h后，取出培養小室，用棉簽輕輕拭去未穿過濾膜的細胞，用4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結晶紫染色30 min。倒置熒光顯微鏡下觀察、照相，并每組隨機選取5個視野計數每高倍視野濾膜底面的平均細胞數。

1.5 ELISA檢測PC-3上清液MMP-2、MMP-3分泌

用0、1、2、4mmol/LNaHS分別作用PC-3細胞36 h后，胰酶消化細胞，以1×104個/孔接種于96孔板，1%血清的F-12培養液培養48 h后，收集上清液，4℃離心，ELISA檢測PC-3上清液MMP-2、MMP-9分泌情況，以0 mmol/L NaHS組為對照組，分泌量為100%。

1.6 Western-Blot法檢測Bcl-2、Bax蛋白的表達

PC-3細胞接種于培養皿中，培養至80%滿時按各試驗組要求加入不同處理因素。按操作說明書提取細胞胞漿蛋白和核蛋白，BCA法進行蛋白定量。總蛋白經SDSPAGE分離后，轉移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉1.5 h。隨后加入抗 Bcl-2（1∶1000）或抗 Bax（1∶1000）或抗GAPDH（1∶3000）4℃孵育過夜，TBST 漂洗 7 min×3 次，加入相應的二抗（羊抗兔 IgG 1∶3000），常溫孵育 1 h，TBST 漂洗10 min×3次。將PVDF膜用發光劑顯色后曝光到X光片上。

1.7 統計學方法

用SPSS 13.0統計軟件進行統計學處理，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析或t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NaHS對前列腺癌骨轉移PC-3細胞存活率的影響

用 0、1、2、4 mmol/L NaHS 分別作用 PC-3 細胞 36 h，與對照組（0 mmol/L NaHS）相比，各組細胞存活率降低。1 mmol/L NaHS組細胞存活率與對照組比較，差異無統計學意義 （P＞0.05）；2、4 mmol/L組與對照組比細胞存活率下降NaHS作用PC-3細胞36 h，細胞存活率降低，與對照組比較，能不同程度抑制PC-3細胞的生長，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。見圖1。

圖1 NaHS降低前列腺癌骨轉移PC-3細胞存活率

2.2 NaHS對前列腺癌骨轉移PC-3細胞侵襲的影響

用 0、1、2、4 mmol/L NaHS 分別作用 PC-3 細胞 24、36 h后，Transwell侵襲實驗觀察NaHS對前列腺癌骨轉移PC-3細胞侵襲的影響。與對照組（0 mmol/L NaHS）相比，各組穿膜細胞數降低。1 mmol/L組與對照組差異無統計學意義（P＞0.05），2、4 mmol/L組與對照組比較細胞存活率下降（P＜0.05或P＜0.01）。見圖2。1 mmol/L NaHS組細胞侵襲數與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；2、4 mmol/L NaHS作用PC-3細胞36 h，細胞侵襲數減少，與對照組比較，能不同程度抑制PC-3細胞的侵襲，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。見圖2。

圖2 NaHS降低前列腺癌骨轉移PC-3細胞侵襲

2.3 NaHS降低前列腺癌骨轉移PC-3細胞分泌MMP-2、MMP-9

用0、1、2、4 mmol/L NaHS分別作用PC-3細胞36 h后，ELISA檢測 PC-3細胞 48 h后上清液中MMP-2、MMP-9表達變化。與對照組（0 mmol/L NaHS）相比，各組MMP-2、MMP-9分泌量降低。1 mmol/L組差異無統計學意義 （P＞0.05），2、4 mmol/L組與對照組比細胞存活率下降（P＜0.05或P＜0.01）。見圖3。1 mmol/L NaHS組細胞MMP-2和MMP-9分泌量與對照組比較，差異無統計學意義 （P＞0.05）；2、4 mmol/L NaHS作用PC-3細胞36 h，MMP-2和MMP-9分泌量減少，與對照組比較，能不同程度抑制PC-3細胞MMP-2和MMP-9的分泌，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。見圖3。

2.4 NaHS對前列腺癌骨轉移PC-3細胞Bcl-2/Bax蛋白表達的影響

用0、1、2、4 mmol/L NaHS分別作用PC-3細胞24 h后，Western blot檢測Bcl-2/Bax蛋白表達變化。與對照組（0 mmol/L NaHS）比較，各組Bcl-2 表達逐漸降低，Bax蛋白表達逐漸升高（圖4）。與對照組（0 mmol/L NaHS）比較，1、2、4 mmol/L NaHS組Bcl-2表達逐漸降低，Bax蛋白表達逐漸升高，呈濃度依賴性（圖4）。

3 討論

硫化氫作為繼一氧化氮、一氧化碳后被發現的第3種氣體信號分子，在不需要載體蛋白的情況下，可直接透過細胞膜，在不同的組織細胞間有不同的生理濃度，對細胞的生長和凋亡起著不同的作用[11]。對腫瘤細胞而言，即使是對同一種腫瘤不同細胞系，硫化氫的所起的作用亦會有所用不同：Cao等[12]報道內源性和外源性硫化氫均抑制結腸癌細胞增殖，而Rose等[13]報道硫化氫抑制HCT116結腸癌細胞凋亡。

本試驗中，2、4 mmol/L NaHS對前列腺癌骨轉移PC-3細胞的存活率有影響（P＜0.05或P＜0.01），而1 mmol/L NaHS差異無統計學意義。提示：較低濃度（1 mol/L）硫化氫對前列腺癌骨轉移PC-3細胞的生長沒有較大影響。較高濃度（2、4 mol/L）硫化氫能抑制前列腺癌骨轉移PC-3細胞的生長。

圖3 NaHS降低前列腺癌骨轉移PC-3細胞分泌MMP-2、MMP-9

圖4 Western blot檢測Bcl-2/Bax蛋白表達變化

通過對胞漿Bcl-2、Bax蛋白蛋白表達的檢測，本文觀察到NaHS能夠降低Bcl-2表達和促進Bax表達。Bcl-2、Bax基因均屬于Bcl-2家族，分別是Bcl-2家族中最具有代表性的抗凋亡和促凋亡的基因。Bax蛋白主要位于胞漿，當凋亡發生時，它從胞漿轉移到線粒體外膜上，調控凋亡誘導蛋白細胞色素C的釋放，導致細胞凋亡[14]。Bcl-2蛋白位于線粒體膜上，能與Bax蛋白結合成二聚體，阻止Bax蛋白的釋放，從而抑制細胞的凋亡[15]。因此，硫化氫可能是通過抑制Bcl-2表達和促進Bax表達來抑制前列腺癌骨轉移PC-3細胞的活性。

腫瘤侵襲和轉移是一個多步驟的、腫瘤細胞與宿主細胞相互作用的生物學過程。其中，細胞外基質（extra cellular matrix，ECM）和血管基膜（basement membrane，BM）的降解是轉移多階段過程中的重要步驟。基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）在該過程中起重要作用，是降解ECM和BM的主要酶類。Brehmer等[16]對40例PCa切除術后的標本以免疫組化方法檢測MMP2和MMP-9，結果表明，與正常前列腺組織相比，MMP-9在腫瘤細胞和腫瘤內及周邊的基質細胞中高表達，MMP-2、MMP-9的表達隨格里森積分增加有1個增加的趨勢。Dong等[17]的實驗研究表明，在前列腺癌細胞PC-3骨轉移組織中，PC-3誘導破骨細胞活性增加以及破骨細胞募集到骨重塑處，都依賴于MMP-9的表達。Sauer等[18]對97例PCa患者血清、活檢組織及前列腺切除術后的腫瘤組織進行MMP-2、MMP-9檢測。結果表明，血清中MMP-9表達顯著增加，且與腫瘤分級有關，而MMP-2在前列腺切除術后的腫瘤組織中，與腫瘤分級呈正相關。

本文研究發現，較低濃度（1 mol/L）硫化氫對前列腺癌骨轉移PC-3細胞的侵襲沒有較大影響。較高濃度（2、4mol/L）硫化氫作用前列腺癌骨轉移PC-3細胞24 h，能使細胞的侵襲數下降，提示較高濃度硫化氫（2、4 mmol/L）能抑制前列腺癌骨轉移PC-3細胞的侵襲，同時較高濃度硫化氫（2、4 mmol/L）能抑制前列腺癌骨轉移PC-3細胞MMP-2、MMP-9分泌，而較低濃度（1 mol/L）硫化氫對前列腺癌骨轉移PC-3細胞MMP-2、MMP-9分泌無明顯影響。因此，硫化氫可能抑制了前列腺癌骨轉移PC-3細胞MMP-2、MMP-9分泌來降低侵襲。

目前的研究發現，以非甾體抗炎藥（NSAID）雙氯芬酸和美沙拉秦為母體合成可釋放H2S的衍生物ATB-337和ATB-429[19-20]，釋放硫化氫的非甾體抗炎藥提高其對前列腺癌細胞的抗癌作用[10]。本研究發現硫化氫可能是通過上述機制來增強非甾體抗炎藥對前列腺癌細胞的抗癌作用。因此，隨著對硫化氫進一步研究，從抑制凋亡和侵襲入手，可能為前列腺癌骨轉移治療提供了一條新的途徑。

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