肝纖維化大鼠血清及肝組織基質(zhì)金屬蛋白酶-1及其抑制因子表達(dá)的變化

羅國(guó)彪 舒建昌

暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬?gòu)V州市紅十字會(huì)醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東廣州 510220

肝纖維化是由于各種致病因子引起肝臟的損傷和炎癥，導(dǎo)致纖維組織廣泛增生和沉積，其發(fā)生、發(fā)展過(guò)程與細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的沉積與降解相對(duì)失衡有關(guān)，而ECM的變化和組織基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP-1）及基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1（TIMP-1）表達(dá)有密切的關(guān)系，本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法，結(jié)合既往實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上[1]，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法、免疫組化染色法分別檢測(cè)正常及肝纖維化大鼠血清及肝組織MMP-1及TIMP-1表達(dá)的變化，分析兩者在肝纖維化中的作用，以期為肝纖維化預(yù)防提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選擇 2011年11月～2013年 11月，SPF級(jí)SD大鼠20只，體質(zhì)量180～200 g，雄性，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[SCXK（粵）200620015粵監(jiān)證字2006B2008]。于廣東省藥物研究所標(biāo)準(zhǔn)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室 （合格證號(hào)：2006C125號(hào)）進(jìn)行動(dòng)物飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 試劑 大鼠MMP-1及大鼠TIMP-1定量檢測(cè)試劑盒（ELISA）（上海西唐生物科技有限公司），大鼠抗MMP-1及大鼠TIMP-1單克隆抗體 （武漢博士德生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 肝纖維化模型建立：根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)[2]及相關(guān)文獻(xiàn)建模[1-3]。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理 20只雄性SD大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為2組，正常組10只大鼠，不作其他處理，常規(guī)飼養(yǎng)12周；模型組10只大鼠，腹腔注射CCl40.025 mL（用花生油1∶6稀釋），每周3次，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)共12周。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用摘眼球采血法最大量取血，并置于未加抗凝劑的普通干凈玻璃試管中。剖開大鼠腹腔暴露肝臟，留取肝臟左葉，留取部分肝組織于4%中性福爾馬林液固定，置于包埋盒中，于切片機(jī)切片，厚度3 μm，裱片于普通載玻片上進(jìn)行免疫組化染色。

1.2.3 指標(biāo)檢測(cè) 按照試劑盒說(shuō)明書以ELISA方法檢測(cè)血清MMP-1和TIMP-1含量；免疫組化染色檢測(cè)肝組織MMP-1和TIMP-1表達(dá)，組織中出現(xiàn)棕色或黃色的部位為陽(yáng)性表達(dá)部位，在高倍鏡（400×）下，每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)視野，采用專業(yè)顯微彩色圖像分析軟件計(jì)算每個(gè)視野下陽(yáng)性部位面積的百分比，取其均值為該張切片的陽(yáng)性表達(dá)面積，再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 12.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩獨(dú)立樣本的計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清MMP-1及TIMP-1含量比較

模型組大鼠血清中MMP-1含量較正常組明顯降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t=13.38，P<0.01），血清中TIMP-1含量升高明顯，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=31.92，P<0.01）。見表1。

表1 血清MMP-1及TIMP-1含量比較（±s）

表1 血清MMP-1及TIMP-1含量比較（±s）

注：與正常組比較，▲P<0.01；MMP-1：基質(zhì)金屬蛋白酶-1；TIMP-1：基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1

553.81±98.89 113.49±18.95▲13.38<0.01 10.17±1.35 25.84±0.76▲31.92<0.01 MMP-1（μg/L） TIMP-1（μg/L）正常組模型組t 值P 10 10組別 只數(shù)

2.2 肝組織MMP-1及TIMP-1陽(yáng)性百分比分析

MMP-1 模型組陽(yáng)性表達(dá)面積比例[（5.60±1.51）%]與正常組比較明顯下降，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.37，P<0.01）。TIMP-1陽(yáng)性百分比分析，模型組陽(yáng)性表達(dá)面積與正常組比較明顯升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=38.96，P<0.01）。見表2。

3 討論

肝纖維化的發(fā)生是一過(guò)復(fù)雜的過(guò)程，往往會(huì)帶來(lái)肝硬化甚至肝癌等不良的后果，積極探索肝纖維化發(fā)病機(jī)制，尋求有效治療措施對(duì)降低肝硬化發(fā)病率具有重要意義。肝纖維化發(fā)生的原因較多，一般是ECM的生成與沉積增加，造成ECM積累，最后導(dǎo)致肝纖維化。肝纖維化的形成過(guò)程主要取決于膠原的合成、沉積、降解、吸收的動(dòng)態(tài)平衡，其消退的特征是肝纖維化基質(zhì)的降解和正常肝組織的恢復(fù)，其發(fā)生、發(fā)展過(guò)程與ECM，特別是膠原的沉積與降解相對(duì)失衡有關(guān)，這種過(guò)度沉積不僅是由于ECM合成增多，更大程度上是由于降解減少引起[4-5]，提示促進(jìn)ECM各成分的降解是抗肝纖維化的重要途徑，影響ECM降解的主要是MMPS和TIMPS，而ECM主要是Ⅰ、Ⅲ型膠原的沉積。目前在肝內(nèi)共發(fā)現(xiàn)了8種基質(zhì)金屬蛋白酶，其中MMP-1能夠降解纖維化中肝臟中ECM的主要成分Ⅰ、Ⅲ型膠原[6]，TIMP-1增加和（或）MMP-1減少，可使ECM降解減少，特別是膠原降解減慢，導(dǎo)致組織纖維化發(fā)生，反之，導(dǎo)致ECM發(fā)生破壞性重建[7]。TIMP-1是體內(nèi)MMP-1的特異性抑制劑，它能通過(guò)其N-末端特異性地與MMP-1催化活性中心的鋅離子結(jié)合，從而封閉其催化活性，使有活性的MMP-1失活[8]，TIMP-1是抑制MMP活性的一組多功能因子家族的主要成員之一，是一種分子質(zhì)量單位約為28.5 kd的糖蛋白，在肝臟中由枯否細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞及肌纖維母細(xì)胞產(chǎn)生。活化的肝星狀細(xì)胞表達(dá)TIMP-1最強(qiáng)，TIMP-1主要抑制MMP-1活性[9]，TIMP-1主要由激活的肝星狀細(xì)胞、肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞分泌，主要作用是抑制膠原酶的活性，同時(shí)抑制基質(zhì)分解素和明膠B，在肝纖維化時(shí)其表達(dá)明顯增加，主要由位于肝中央靜脈、匯管區(qū)周圍及肝竇壁的間質(zhì)細(xì)胞分泌[10]，因而TIMP-1在肝組織中的表達(dá)水平可以反映肝組織學(xué)纖維化程度[11-12]。前期研究顯示，經(jīng)復(fù)方中藥干預(yù)的大鼠肝組織中的Ⅰ、Ⅲ型膠原含量明顯降低，造模組MMP-1表達(dá)降低、TIMP-1表達(dá)升高，復(fù)方中藥組MMP-1表達(dá)明顯升高，與造模組相比，正常組及復(fù)方中藥組MMP-1表達(dá)顯著升高，TIMP-1表達(dá)明顯降低[13-16]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。本研究結(jié)果顯示，血清及肝組織MMP-1及TIMP-1與肝纖維化關(guān)系密切，史玉嶺[17]使用ROC曲線評(píng)估TIMP-1診斷肝纖維化的敏感度、特異性，明顯高于肝纖維化標(biāo)記物HA、PCⅢ、CⅣ、LN，提示血清 TIMP-1診斷肝纖維化有較高的敏感度和特異性，其水平可反映肝纖維化的程度。

表2 各組大鼠肝組織MMP-1及TIMP-1免疫組化圖像分析面積百分比（%，±s）

表2 各組大鼠肝組織MMP-1及TIMP-1免疫組化圖像分析面積百分比（%，±s）

注：與正常組比較，▲P<0.01；MMP-1：基質(zhì)金屬蛋白酶-1；TIMP-1：基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1

19.20±1.48 5.60±1.51▲14.37<0.01 3.22±0.70 17.10±0.84▲38.96<0.01 MMP-1 TIMP-1正常組模型組t 值P 10 10組別 只數(shù)

本研究為肝纖維化判斷指標(biāo)提供實(shí)驗(yàn)佐證并為臨床上尋找治療肝纖維化藥物打下了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，而如何調(diào)節(jié)MMP-1及TIMP-1兩者的平衡，抑制TIMP-1的表達(dá)將為防治肝纖維化提供新的研究方向。

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