高效液相色譜法同時測定喹啉酸和喹啉

趙建宏，李亞芳，王建設，王留成，宋成盈

(鄭州大學化工與能源學院，河南鄭州450001)

0 引言

喹啉酸，又名2，3-吡啶二羧酸，屬煙酸類化合物，是一種重要的農藥、醫藥及壓敏色素中間體，主要用于合成含吡啶或喹啉環的咪唑啉酮類除草劑，也可用于合成抗生素、復合維生素 B等［1］.目前喹啉酸的合成方法分為化學氧化法［1-3］和電化學氧化法［4-5］.根據氧化劑的不同，化學氧化法又分為高錳酸鉀氧化法、雙氧水氧化法、臭氧分解氧化法、氯酸鈉氧化法等，這些方法使用了大量的氧化劑和催化劑，產物復雜難以分離提純，且污染嚴重.相比來說，電化學氧化法工藝流程短、產品質量高、三廢污染少、生產成本低，是一種很有發展前景的合成方法，但是產品收率和電流效率的判斷是建立在產物的快速準確分析基礎上的.電合成反應液中除主產物喹啉酸外，還有未反應的喹啉、副產品草酸及支持電解質硫酸等.目前的稱重法［6-7］是使喹啉酸以其銅鹽形式析出，或經中和、酸化、結晶出喹啉酸純品后洗滌，干燥，然后稱重，操作繁瑣，準確度差.其他單獨分析喹啉酸或喹啉的方法主要有氣相色譜法和液相色譜法［8-10］，但由于電合成反應液中含有大量無機酸和水，氣相色譜法分析時需經過復雜的預處理，而目前采用液相色譜法測定喹啉酸和喹啉時須采用不同的流動相體系，操作繁瑣，耗時較長，同時分析反應液中這兩種物質的方法未見報道.本實驗采用高效液相色譜，建立了同時分析喹啉酸和喹啉含量的方法，該方法快速、準確，解決了電合成反應液的快速分析問題，為喹啉酸的生產工藝優化和產品質量控制提供了有效支持.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200型高效液相色譜儀(安捷倫公司);UV22401PC型紫外-可見分光光度計(島津公司);AW220型電子分析天平(島津公司);KQ-100E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司).

喹啉酸標準品(含量≥99.5%，綿陽崴尼達醫藥科技有限責任公司);喹啉標準品(含量≥99.5%，北京化學試劑公司);甲醇與乙腈為色譜純(國藥集團化學試劑公司);磷酸和磷酸氫二鉀均為分析純(國藥集團化學試劑公司);10%四丁基氫氧化銨(上海華碩精細化學品有限公司)，實驗用水為二次蒸餾水.

1.2 色譜條件

Hypersil C18型(150 mm×4.6 mm i.d)色譜柱;檢測波長254 nm;流動相為V(甲醇)∶V(含0.1%四丁基氫氧化銨的磷酸鹽緩沖溶液，pH=7.0)=50∶50，超聲 15 min，經 0.45 μm 濾膜過濾;柱溫 30℃;流速 0.9 mL·min-1;進樣量20 μL.

1.3 實驗方法

標準溶液的配制:分別準確稱取一定量的喹啉酸和喹啉于50 mL的容量瓶中，用流動相溶解并定容，經0.45 μm濾膜過濾后備用.

樣品溶液的配制:準確稱取2.0～2.5 g電合成反應液樣品于50 mL的容量瓶中，用水稀釋并定容，再從中移取5 mL溶液于10 mL的容量瓶中，用20%的氫氧化鈉溶液調節pH至7.0，然后用流動相稀釋并定容，經濾膜過濾后進樣，以峰面積外標標準曲線法定量［11］.

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 檢測波長的確定

分別配制一定濃度的喹啉酸和喹啉標準溶液，在紫外分光光度計上進行全波長掃描，掃描范圍190～400 nm.結果顯示，喹啉酸和喹啉的最大吸收波長分別在242 nm和313 nm.實驗選取254 nm作為檢測波長，雖然在該波長下喹啉酸和喹啉的吸收強度略有下降，但是其他雜質吸收峰的干擾較少，基線穩定，因此可以選為最佳檢測波長.

2.1.2 流動相組成及pH的確定

實驗選用C18(150 mm×4.6 mm i.d)色譜柱對流動相組成和比例進行了優化.結果發現，用乙腈-水體系做流動相時，洗脫能力太強，出峰過早且分離效果不好.采用甲醇-水體系時樣品峰形和分離度均較好，且因甲醇對樣品溶解性好，樣品在柱內殘留量少.綜合考慮，該實驗采用甲醇-水體系.

對于反應液中待分析的喹啉酸和喹啉，喹啉酸為水溶性兩性化合物(pKa=2.43)，在反相色譜柱上幾乎無保留，而喹啉為醇溶性弱堿(pKa=4.95)，兩樣品的酸堿性和極性差異較大.為保證喹啉酸和喹啉均以一種形式(離子或中性化合物形式)存在，分別在強酸性(pH=2.5左右)和中性(pH=7.0左右)磷酸鹽緩沖溶液中進行實驗.結果顯示，在酸性條件下，喹啉酸峰形尖銳、但喹啉峰拖尾嚴重，幾乎不成峰;在中性條件下，喹啉出峰對稱，但喹啉酸出現明顯的峰前沿現象，且峰展較寬.因此，考慮向流動相中加入離子對試劑以改善峰形，因喹啉酸樣品中含羧基，宜選用有機銨鹽做離子對試劑.本實驗分別選用四丁基硫酸氫銨、四丁基氫氧化銨、四丁基溴化銨和四丁基氯化銨為離子對試劑.結果表明，在流動相中加入適量的四丁基氫氧化銨時，喹啉酸峰形明顯改善，喹啉峰形亦不受其干擾.

進一步實驗表明，甲醇體積分數小于40%時，各組分完全分離但喹啉保留時間延長，峰展較寬，峰對稱性下降;甲醇體積分數大于70%時，峰形對稱，但出峰太早，分離效果不好.總體考慮，甲醇體積分數為50%時，喹啉酸和喹啉均有合適的保留時間，且分離較好.

2.1.3 流速及柱溫的確定

流動相的流速對喹啉酸和喹啉的分離度及峰形有一定的影響.隨著流速的增大，色譜峰峰形變得尖銳，保留時間縮短，但同時分離度變小，柱壓升高.流速減小，峰形變寬，保留時間延長，分離度變大，柱壓降低.綜合考慮，宜采用流速 0.9 mL·min-1.

在此流速下，又分別在柱溫25，30，35，40℃進行了實驗.結果表明，柱溫對峰形及分離度影響不大.考慮到柱溫升高降低流動相黏度，提高其流動性，降低柱壓，但同時加熱對色譜柱有一定損傷.綜合考慮，宜采用柱溫30℃.圖1為優化的色譜條件下標準樣品和反應液樣品的色譜圖，其中喹啉酸、喹啉的保留時間分別為1.699 min、6.022 min.顯然，待測物喹啉酸、喹啉與反應副產品草酸及雜質的分離良好，峰型對稱，基線平穩.

2.2 標準曲線及檢出限

分別精密吸取上述標準溶液 1，3，5，7，9 mL于10 mL的容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，得到一系列不同濃度的喹啉酸和喹啉混合標準液.所有樣品經0.45 μm濾膜過濾后進樣，每個樣品平行進樣3次，以峰面積y為縱坐標，質量濃度x為橫坐標進行線性回歸.喹啉酸和喹啉的標準線性回歸方程、線性范圍及相關系數均列于表1中.以3倍基線噪聲測得的喹啉酸和喹啉的檢測限也列于表1中.結果表明，所優化的色譜條件下測定的喹啉酸和喹啉濃度線性范圍均較寬，線性關系良好.

2.3 方法的精密度

分別取高、中、低3個濃度的喹啉酸和喹啉標準溶液，按同樣的方法和色譜條件重復測定，每份溶液進樣3次，結果見表2.結果顯示，喹啉酸和喹啉的最大相對標準偏差分別為0.70% 和0.56%，說明該測定方法具有較好的重復性.

2.4 回收率實驗

取不同反應條件下的反應液樣品3份，分別加入一定量的喹啉酸和喹啉標準品，然后按同樣的方法和色譜條件重復測定，每份溶液進樣3次，計算回收率.結果列于表3中.由表可知，喹啉酸的回收率為98.40% ～102.0%，喹啉的回收率在98.80%～99.70%，說明在優化的色譜條件下測定結果的準確度較高，可用于喹啉酸合成工藝優化及其他相關研究.

圖1 標準樣品及反應液樣品色譜圖Fig.1 Chromatograms of standard sample and synthetic sample

表1 喹啉酸和喹啉的線性回歸及檢出限Tab.1 Regression analysis and detection limits of quinolinic acid and quinoline

表2 方法的精密度Tab.2 Precision of the method

表3 喹啉酸和喹啉的回收率Tab.3 Recoveries of quinolinic acid and quinoline

續表3

3 結論

使用Hypersil C18型反相色譜柱，以V(甲醇)∶V(含0.1%四丁基氫氧化銨的磷酸鹽緩沖溶液，pH為7.0)=50∶50為流動相，建立了同時檢測電合成反應液中喹啉酸和喹啉的液相分析方法.該方法具有良好的精密度和準確度，可在10 min內完成電合成反應液的全分析，適用于喹啉酸合成工藝優化及其他相關研究中.

［1］GISELBRECHT K，PERNDORFER E，REITER K.Process for preparation of 2，3-pyridinecarboxylic acids:US，0062025 A1 ［P］.2002-05-23.

［2］MICHALOWICZ W.Process for preparation of pyridine-2，3-dicarboxylic acid:US，4754039 ［P］.1988-06-28.

［3］REBHAHN W，ROBERT W J，JAMES E K，et al.Process forpreparation ofquinolinic acid:US，4537971［P］.1985-08-27.

［4］GUPTA P N，RATHER G M.Electrochemical synthesis of quinolinic acid from quinoline［J］.Asia Journal of Chemistry，1989，1(1):52-56.

［5］蘇育志，朱長纓.喹啉酸的電合成［J］.廣州師院學報，1998，19(6):69-73.

［6］李健，劉冬杰，王萍，等.喹啉酸的生產方法:中國，CN 102399182［P］.2012-04-04.

［7］ORTH W，PASTOREK E，FICKER W.Oxidation of quinoline to quinolinic acid:US，549024［P］.1985-10-22.

［8］熊纓，周岐新.生物樣本中喹啉酸含量測定方法的研究進展［J］.兒科藥學雜志，2005，11(4):7-9.

［9］朱順妮，樊麗，倪晉仁.兩株喹啉降解菌代謝途的分析［J］.中國環境科學，2008，28(5):456-460.

［10］胡益之，王祖侗，童仕唐.喹啉、異喹啉加氫脫氮反應歷程及宏觀動力學［J］.石油煉制，1983(7):1-11.

［11］曹軍艷，葛慶平，李嬌嬌，等.高效液相色譜法測定電合成反應液中的 3，6-DCP和 3，4，5，6– TCP［J］.鄭州大學學報:工學版，2012，33(6):100-103.