頂空氣相色譜法測定帕托珠利原料藥中乙醇的殘留量

范 瑩，蘇 勍

帕托珠利是一類與妥曲珠利相關(guān)的三嗪類抗球蟲藥物，是妥曲珠利的主要代謝產(chǎn)物，又名妥曲珠利砜。該藥于2001年由美國FDA批準(zhǔn)上市，用于治療洪氏新孢子蟲（Neospora hughesi）和肉孢子蟲（S.neurona）引起的哺乳動物中樞性疾病，有效的緩解EPM癥狀。研究表明，帕托珠利在動物體內(nèi)殺死球蟲的同時不影響動物自身免疫力的產(chǎn)生[1，2]。為確保藥品質(zhì)量，建立了同時測定帕托珠利中可能含有的殘留溶劑的頂空氣相色譜方法[3]。

1 儀器與試劑

Agilent 6890N氣相色譜儀，氫火焰離子化檢測器（FID），Agilent G1888頂空進(jìn)樣器，6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷毛細(xì)管柱（DB-624）（美國安捷倫公司），N，N-二甲基甲酰胺、乙醇均為色譜純，帕托珠利（批號：0813、0814、0815）為課題組自制。

圖 1 專屬性試驗氣相色譜圖

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：DB-624 （30 m×0.32 mm，1.8 μm）；程序升溫：起始溫度40℃，保持6 min，再以30℃/min的速率升溫至200℃，保持5 min；載氣為高純氮氣，載氣壓力為55 kPa（1 kPa=7.5 mmHg）；進(jìn)樣口溫度：200 ℃；檢測器（FID）溫度：250℃；頂空瓶平衡溫度：100℃，平衡時間30 min；進(jìn)樣量：1 ml；進(jìn)樣方式為分流進(jìn)樣，分流比為 15∶1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液 取帕托珠利0.2 g，精密稱定，置頂空瓶中，精密加N,N-二甲基甲酰胺2 ml使溶解，密封，作為供試品溶液。

2.2.2 對照品儲備液 精密稱取乙醇125 mg，置25 ml量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。

2.2.3 對照品溶液 精密量取對照品儲備液1.0 ml，置10 ml量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。精密量取對照品溶液2.0 ml，置頂空瓶中，密封。

2.3 專屬性試驗 精密量取對照品溶液2 ml加入至裝有供試品溶液的頂空瓶中，分別將空白溶液、對照品溶液、供試品溶液、對照品和供試品混合溶液頂空進(jìn)樣，得氣相色譜圖。由氣相色譜圖可得各成分之間的分離度均符合要求，表明專屬性良好（圖 1）。

2.4 檢出限和定量限 取對照品溶液，逐級稀釋，按擬定色譜條件測定，記錄色譜圖。按《中國藥典》2010版（二部）附錄ⅪⅩ項[4]規(guī)定，一般以信噪比為3∶1時相應(yīng)濃度作為該物質(zhì)的檢出限，以信噪比為10∶1時相應(yīng)濃度作為該物質(zhì)的定量限；計算得乙醇的檢出限為0.01 mg/ml；丙酮、乙醇的定量限為0.025 mg/ml。

2.5 線性和范圍試驗 精密量取對照品儲備液0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 ml，分別置 10 ml量瓶中，加 N,N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取上述溶液2.0 ml置頂空瓶中，密封，按擬定色譜條件測定，記錄色譜圖。以乙醇的濃度為橫坐標(biāo)（mg/ml），以測得的峰面積為縱坐標(biāo)（A）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：

乙醇回歸方程：Y=752.8X-53，r=0.9988

表明乙醇在0.25~0.75 mg/ml范圍內(nèi)濃度與峰面積的線性關(guān)系良好。

2.6 重復(fù)性 取批號為0813的樣品，按2.2.1項下方法配制6份供試品溶液，按擬定的色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。均未檢出乙醇。

2.7 精密度 按2.2.3項下方法配制對照品溶液，按擬定的色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，計算乙醇峰面積的RSD為2.12%。

2.8 穩(wěn)定性試驗 按2.2.3項下方法配制對照品溶液，在室溫下放置，分別在0、4、8、12 h按擬定的色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，計算得乙醇峰面積的RSD為1.77%，表明對照品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 回收率試驗 稱取9份帕托珠利樣品，各1 g，精密稱定，分別置10 ml量瓶中，3份一組，分別精密加入適量對照品儲備溶液，加N,N-二甲基甲酰胺定容至刻度，搖勻，制成乙醇的濃度分別為限量的80%、100%、120%，分別精密量取2 ml置頂空瓶中，密封，按擬定的色譜條件測定，記錄色譜圖。計算乙醇的回收率。結(jié)果見表1。

2.10 樣品的測定 取三批供試品，批號分別為0813、0814、0815按2.2.1項下方法，配制供試品溶液，按擬定的色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，均未檢出乙醇。

表 1 回收率試驗結(jié)果（n=9）

3 討論

殘留溶劑的選擇是按照《中國藥典》2010年版附錄Ⅷ P“殘留溶劑測定法”項[5]：藥品中的殘留溶劑系指在原料藥或輔料的生產(chǎn)過程中，以及在制劑制備過程中使用的，但在工藝過程中未能完全去除的有機(jī)溶劑。本次實驗根據(jù)此項原則和生產(chǎn)工藝確定需要檢測的殘留溶劑為乙醇。

考慮到帕托珠利原料藥和需要檢測的殘留溶劑的溶解性，本次實驗使用N,N-二甲基甲酰胺作為溶劑；并對建立的方法進(jìn)行專屬性、精密度、準(zhǔn)確度、線性和范圍等方面的試驗驗證，結(jié)果表明，本文建立的方法簡便、快速、準(zhǔn)確，可有效檢測帕托珠利中的殘留溶劑。

[1]楊 慧，潘保良幸，汪 明.抗球蟲新藥帕托珠利的研究[A].第二屆京津冀畜牧獸醫(yī)科技創(chuàng)新論壇暨第六屆新思想、新方法、新觀點“首農(nóng)杯”論壇論文集[C].2010.76.

[2]施祖灝，葛慶聯(lián)，陸俊賢，等.同時檢測2種均三嗪類抗球蟲藥物殘留的樣品前處理方法的比較[J].色譜，2009，27（3）：303-307.

[3]戴正琳，陶 志，章平榮.頂空毛細(xì)管氣相色譜法測定阿折地平中的溶劑殘留[J]. 中國藥師，2012，15（2）：197-198.

[4]中華人民共和國藥典委員會.中國藥典（二部）[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.附錄194-195.

[5]中華人民共和國藥典委員會.中國藥典（二部）[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.附錄61-63.