兩種電泳方法血紅蛋白分析一致性的比較

陳永秀，周云珍，陳錦宏，李樹全，龍桂芳

(1.橫縣人民醫院檢驗科，廣西 橫縣 530300;2.橫縣人民醫院產科，廣西 橫縣 530300;3.橫縣人民醫院血液科，廣西 橫縣 530300;4.廣西醫科大學第一附屬醫院血紅蛋白研究室，廣西 南寧 530021)

地中海貧血是一類以珠蛋白α鏈或β鏈合成不足或缺失為特征的隱性遺傳性疾病。最常見為α-地中海貧血和β-地中海貧血，我國以南方地區多見，如廣西、廣東，四川、云南等地。開展地中海貧血檢測是臨床上診斷貧血必不可少的項目。目前很多基層醫院采用Sebia Hydrasys LC瓊脂糖凝膠電泳系統(簡稱瓊脂糖凝膠電泳)替代醋酸纖維素薄膜電泳對地中海貧血進行篩查。為比較2種電泳方法的一致性，我們進行了相關實驗。

材料和方法

一、一般資料

4126例臨床標本來自2009年5月至2011年5月期間橫縣人民醫院門診和住院患者及其他體檢人員。男1862例，女2264例，年齡5個月～75歲。

二、儀器與試劑

1.瓊脂糖凝膠電泳 法國Sebia公司生產的Sebia Hydrasys LC全自動瓊脂糖凝膠電泳系統及其配套的HYRYS掃描系統，Hb瓊脂糖凝膠試劑、緩沖條、染色劑、紅細胞溶解液由法國SEBIA公司配套提供。脫色液(0.1%冰醋酸)自配。

2.醋酸纖維素薄膜電泳 北京市六一儀器廠生產的DYY-2C型電泳儀及電泳槽，山東高密醫儀器公司生產的半自動生化儀，自配的試劑(包括浸醋酸纖維素薄膜Tris緩沖液、硼酸緩沖液、麗春紅染色液、3%醋酸溶液，抗堿血紅蛋白測定用酸性半飽和硫酸銨溶液、NaOH溶液。)及具體操作按《全國臨床檢驗操作規程》(第3版)[1]進行。

三、方法

1.瓊脂糖凝膠電泳 按儀器操作說明書進行，將已用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝的靜脈血用生理鹽水反復洗滌3次處理，吸取10 μL壓積紅細胞進行溶解，按說明書進行操作，電泳、染色烘干后用HYRYS掃描系統掃描電泳膠片，對各條區帶進行定量分析。

2.醋酸纖維素薄膜電泳 按《全國臨床檢驗操作規程》(第3版)[1]采用醋酸纖維素薄膜電泳檢測 HbA、HbA2、HbH 、HbBart's、HbCS。將已用EDTA-K2抗凝的靜脈血用生理鹽水反復洗滌3次處理，用蒸餾水制成溶血液點樣電泳，微量醋酸纖維薄膜電泳觀察區帶。

3.HbF含量測定 用堿變性試驗測定HbF含量。按《全國臨床檢驗操作規程》(第3版)[1]進行。

4.其他試驗 H包涵體試驗、異丙醇試驗、紅細胞脆性試驗(一管法)、血常規檢查。2種電泳方法檢測不一致的樣本送廣西醫科大學第一附屬醫院血紅蛋白研究室進行基因分析確診。

四、統計學方法

兩樣本率比較用χ2檢驗。

結 果

一、2種電泳方法在β-地中海貧血篩查中的比較

4126例樣本中瓊脂糖凝膠電泳共檢出β-地中海貧血 686例，檢出率為 16.63%，其中單HbA2增高 574例、單 HbF增高 47例、HbA2+HbF同時增高65例。醋酸纖維素薄膜電泳檢出β-地中海貧血683例，檢出率為16.55%，其中單HbA2增高 572例、單 HbF增高 49例、HbA2+HbF同時增高62例。對瓊脂糖凝膠電泳檢測出HbF增高(＞3%)的樣本采用堿變性試驗進行復檢，二者結果基本一致。2種電泳方法對HbA2和HbF增高的檢出情況見表1、2。

表1 2種電泳方法對HbA2升高的檢測一致性比較(例)

表2 2種電泳方法對HbF升高的檢測一致性比較(例)

二、2種電泳方法在α-地中海貧血篩查中的比較

4126例樣本中瓊脂糖凝膠電泳系統共檢出α-地中海貧血(HbA2降低)321例，檢出率為7.78%;醋酸纖維素薄膜電泳檢出α-地中海貧血(HbA2降低)323例，檢出率為7.82%。2種電泳方法對HbA2降低的檢出情況見表3。

三、2種電泳方法對 HbH、HbBart's、HbCS區帶檢出率的比較。

2種電泳方法對HbH、HbBart's、HbCS區帶的檢出情況見表4～6。瓊脂糖凝膠電泳對HbH、Hb-Bart's和 HbCS區帶的檢出率分別為 2.50%、1.72%和1.52%;醋酸纖維素薄膜電泳分別為3.42%、2.45%和1.58%。經基因分析確診，瓊脂糖凝膠電泳漏檢HbH 38例、HbBart's 30例、HbCS 2例。2種方法對HbH和HbBart's區帶的檢出率差異有統計學意義(P＜0.05)，對HbCS區帶的檢出率差異無統計學意義(P＞0.05)。

表3 2種電泳方法對HbA2降低的檢測一致性比較(例)

表4 2種電泳方法檢出HbH區帶的一致性比較(例)

表5 2種電泳方法檢出HbBart's區帶的一致性比較(例)

表6 2種電泳方法對HbH、Hb Bart's、HbCS區帶的檢測率比較[例(%)]

觀察瓊脂糖凝膠電泳漏檢的38例HbH、30例HbBart's區帶圖譜可發現HbA2區帶大多淡染、HbH及HbBart's區帶呈淡藍色，散在云霧狀，而醋酸纖維素薄膜電泳區帶清淅。38例瓊脂糖凝膠電泳漏檢的HbH病經送廣西醫科大學第一附屬醫院血紅蛋白研究室進行基因分析確診，全部為缺3個α基因中間型α地中海貧血HbH病。見表7。其中6例2種方法的區帶圖譜見圖1。

表7 2種方法檢測不一致的38例HbH病樣本基因分析結果

圖1 全自動瓊脂糖凝膠電泳漏檢的部分HbH區帶與HbBart's區帶圖譜

三、其他試驗結果

4126例樣本中H包涵體試驗陽性149例、異丙醇試驗陽性273例、紅細胞脆性試驗(一管法)陽性 1206例、紅細胞平均體積(MCV)≤80 fL且平均紅細胞血紅蛋白含量(MCH)≤25.0 pg 3672例。

討 論

瓊脂糖凝膠電泳法是根據不同Hb分子所帶電荷不同，在電場中遷移率不同而達到分離Hb不同成份目的。經染色、脫色、固定，在一定波長下可掃描定量出各組分的百分比。在堿性pH值條件下，用瓊脂凝膠為載體，可分離出正常的Hb中的 HbA、HbA2、HbF 等成份[2]。瓊脂糖凝膠電泳較醋酸纖維素薄膜電泳分辨力強、區帶整齊、吸附小[3]，且在全自動掃描儀上掃描定量，可避免人工操作帶來技術上的誤差，保證血紅蛋白電泳各區帶定量的準確性[4]。醋酸纖維素薄膜電泳對HbF的分辨有一定的限制，所以電泳的同時需要用HbF堿變性試驗測定HbF含量，步驟比較繁瑣。使用法國Sebia-Hydrasys LC全自動瓊脂糖凝膠電泳系統，當HbF＞3%時HbA區帶與HbF區帶分離得較開，掃描HbF定量比較方便、準確，既能直接用肉眼觀察HbA2是否增高，又可掃描HbA2含量;能嚴格控制試驗條件，減少人為誤差，結果準確。HbF增高的病例也可直接掃描HbF含量，從而代替HbF堿變性試驗[5]。瓊脂糖凝膠電泳能準確分離各種區帶，圖譜可永久保存[6];而醋酸纖維素薄膜較脆，容易破碎，區帶顏色容易脫，不易保存。

然而，對于HbH和HbBart's區帶，醋酸纖維素薄膜電泳的分離能力強于瓊脂糖凝膠電泳，可清淅地分離出HbH區帶與HbBart's區帶。本研究結果顯示瓊脂糖凝膠電泳檢出的103例HbH及71例HbBart's區帶用醋酸纖維素薄膜電泳全部檢測出來，并多檢出了38例HbH及30例Hb-Bart's區帶。38例HbH病經廣西醫科大學第一附屬醫院血紅蛋白研究室進行基因分析確診，全部為缺3個α基因中間型α地中海貧血HbH病。瓊脂糖凝膠電泳未檢出HbH及HbBart's區帶的原因可能是HbH及HbBart's是一種不穩定的血紅蛋白，很容易受外界因素的影響如溫度、電壓及緩沖液等破壞，使其無法分離或分離不清，染色后出現HbH及HbBart's區帶淡染，區帶分離不清就會導致掃描不出HbH、HbBart's區帶，造成漏診。在2種電泳方法檢出的141例α-地中海貧血中，發現了以下的情況:(1)HbA2區帶定量降低;(2)紅細胞脆性試驗陽性;(3)異丙醇試驗陽性;(4)血常規檢測中 Hb含量降低、MCV、MCH降低;(5)觀察瓊脂糖凝膠電泳漏檢的38例HbH、30例HbBart's的圖譜區帶，發現HbH及HbBart's區帶呈淡藍色，散在云霧狀。目前很多基層醫院使用瓊脂糖凝膠電泳篩查地中海貧血，認為醋酸纖維素薄膜電泳使用不便，不用醋酸纖維素薄膜電泳進行復檢。因此建議在使用瓊脂糖凝膠電泳篩查地中海貧血時，如發現上述現象應采用醋酸纖素維薄膜電泳復檢，比色定量測定HbH及HbBart's區帶，以免漏檢。

總之，瓊脂糖凝膠電泳篩查地中海貧血具有簡便、快捷、多數區帶定量準確等優點，但對部分HbH及HbBart's區帶卻不能準確檢出，應注意結合其他實驗陽性現象以避免漏檢HbH病。另外，電泳方法只能檢測出HbH中間型及部分輕型地中海貧血，而有些輕型地中海貧血檢測不出，因而必須配合其他實驗室檢查及做家系調查。在群體篩查和普查地中海貧血時可以使用血紅蛋白電泳方法，但在臨床確診和產前診斷時必須做地中海貧血基因分析。

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