中和確認試驗在電化學發光免疫法檢測乙型肝炎表面抗原弱反應性中的價值探討

胡 堯，劉維薇，黃志基

(復旦大學附屬華山醫院檢驗科，上海 200040)

乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)是乙型肝炎診斷及治療評估的重要血清學標志物。在我國的乙型肝炎病毒(HBV)感染人群中，有一部分血清HBsAg呈低水平狀態存在，用傳統的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測，這部分患者往往會被漏檢。隨著微粒子酶免疫熒光法(micropartical enzyme immunofluorescence assay，MEIA)和電化學發光免疫法(electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA)代替 ELISA，HBsAg檢測的敏感性和特異性得到顯著提高，特別是對攜帶弱反應性HBsAg人群的檢出率明顯提高。但在檢測敏感性提高的同時，這些弱反應性HBsAg檢出存在著假陽性，需要對部分HBsAg弱反應性結果進行確認。為此，我們對采用ECLIA檢測弱反應性HBsAg的血清標本進行確認，并對確認結果進行分析和討論。

材料和方法

一、研究對象

2010年6月至2011年2月采用羅氏MODULAR ANALYTICS E-170全自動電化學發光免疫分析儀檢測華山醫院門診及住院患者HBV血清標志物，其中弱反應性 HBsAg(1.0 ＜COI＜50.0)100例，男63例，女37例，年齡21～89歲。

二、儀器和試劑

1.儀器 MODULAR ANALYTICS E-170全自動電化學發光免疫分析儀，瑞士羅氏公司。

2.試劑 HBV血清標志物檢測試劑盒包括HBsAg及其抗體(抗HBs)、HBV e抗原(HBeAg)及其抗體(抗 HBe)、HBV核心抗體(抗 HBc)，HBsAg確認試驗試劑盒以及HBsAg校準品[溯源至世界衛生組織(WHO)HBsAg國際標準品，亞型adw 2.00/558]，瑞士羅氏公司。室內質控，Hepatitis and Retrovirus，美國伯樂公司。

三、方法

1.HBV血清標志物、定標品、室內質控品的檢測 采用ECLIA，按照羅氏E-170全自動電化學發光免疫分析儀的操作規程進行，所測結果均由儀器自動完成。HBsAg＞1.0COI時判為陽性，所有結果均經過復檢。

2.HBsAg中和確認試驗 操作嚴格按照羅氏E-170儀器的操作規程進行。所有標本均經13000×g離心10 min。在標本中加入特異性針對HBsAg的人型中和抗體(確認試劑)，如果血清中存在HBsAg，則會被特異性的抗體中和。同時測定同一標本加入中和抗體(確認試劑)與未加入中和抗體(對照試劑)的COI值，分別用COI(確認)和COI(對照)表示，計算X=COI(確認)/COI(對照)×100。結果判斷見表1。

表1 確認試驗判斷標準

四、統計學方法

結 果

一、100份弱反應性HBsAg標本的確認試驗

10例陰性結果和3例不確定標本的COI值在1.01 ～1.97 之間，結果見表2。

二、弱反應性HBsAg確認結果的ROC曲線分析

采用SPSS 11.5軟件對弱反應性HBsAg確認試驗結果進行ROC曲線分析，曲線下面積為0.945±0.0215，當ECLIA 檢測HBsAg的 COI值為1.97 時，特異性可達100.0%，敏感性為83.9%。見圖1。

三、不同乙型肝炎血清學標志物模式標本低水平HBsAg確認結果

HBsAg陽性設定為1，抗HBs陽性設定為2，HBeAg陽性設定為3，抗 HBe陽性設定為4，抗HBc陽性設定為5，結果見表3。

表2 100份HBsAg標本確認試驗結果[例(%)]

圖1 弱反應性HBsAg確認結果的ROC曲線

表3 不同乙型肝炎血清學標志物模式標本HBsAg確認結果

討 論

血清HBsAg的弱反應性存在可能與HBV感染患者年齡增長，HBV的整合、清除、變異，血清學轉換，出現抗HBs以及含HBV循環免疫復合物的形成等有關，并與來自宿主方面的諸多因素有關[1-2]。因此準確檢測并報告低水平的HBsAg具有重要的流行病學和臨床意義[3]。

然而HBsAg檢測結果呈弱反應性可能是假陽性結果[4]。引起HBsAg假陽性有多種原因，目前認為主要分3類:第1類是由于標本分析前和分析中處理不當，主要是隨機誤差引起的，如血液標本的凝集不完全等所致[5]，可通過同一標本復檢排除。我們收集的100例標本，均經高速離心復檢，剔除可能存在的第1類假陽性的標本。第2類是同一標本復檢不能排除，必須進行特異抗體中和試驗才能排除，可能存在某些非特異性干擾物質[6]。國內文獻對 ELISA[7]、MEIA[8-9]等方法檢測低水平HBsAg的確認試驗報道較多，但對ECLIA方法相對報道較少。我們對100例HBsAg檢測結果COI值在1.00～50.0的血清標本進行確認試驗，確認結果陽性率為87.0%，陰性率為10.0%，還有3例為不確定結果;10例陰性結果和3例不確定標本的COI值在1.01～1.97之間;而當COI值＞1.97時，確認結果的符合率達到100.0%(79/79)，因此ECLIA對弱反應性HBsAg檢測不僅敏感性高，而且具有較高的特異性。ROC曲線分析結果顯示，當ECLIA檢測HBsAg的COI為1.97時，特異性可達100.0%，敏感性為83.9%。我們認為采用ECLIA系統檢測HB-sAg出現弱反應性結果時，當COI值＞2.00，基本可以排除假陽性的可能，無需再做確認試驗;而當1.00＜COI＜2.00時，建議對這部分被檢者進行復檢和隨訪，如有可能最好進一步做確認試驗進行確認。由于本研究標本數量有限，尚需大量試驗證實。第3類是中和確認試驗也不能排除，本次研究有3例確認結果為不確定。究其原因各類文獻都有報道，如HBV疫苗接種后，但此類干擾持續時間較短[10]。因此，對患者進行短期隨訪，對于HBsAg的確認具有重要價值。

本研究還發現，弱反應性HBsAg標本中約有80%的患者處于乙型肝炎“小三陽”狀態。主要原因是，病程在轉換過程中HBsAg含量較低;約有7%的患者存在抗HBs同時陽性，可能存在HBsAg/抗HBs的血清學轉換。乙型肝炎血清標志物僅HBsAg陽性4例，經確認試驗為陰性，可能存在干擾物質。3例不確定的標本，HBV血清標志物抗HBe、抗HBc呈陽性，需要進一步隨訪。

美國病理學家協會(College of American Pathologists，CAP)在其能力驗證(proficiency testing，PT)中要求對弱反應性HBsAg結果進行確認。中和確認試驗對于ECLIA檢測的弱反應性HBsAg結果的確認是一種特異性和敏感性較高的方法。

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