關于免疫透射比濁法測定波長選擇的探討

董曉妮，張文灝

(涿州市中醫院，河北 涿州 072750)

近年來隨著大型全自動生化分析儀的普及以及免疫診斷的發展，免疫透射比濁法檢測項目不斷增加，正確理解和設置生化分析儀參數對提高分析敏感性和特異性以及保證檢驗結果的準確性有重要的指導作用。采用免疫透射比濁法原理測定的項目參數設置具有一定的特殊性，我們僅就測定波長的選擇進行了探討。

一、免疫透射比濁法的檢測原理

免疫透射比濁法的檢測原理近似符合雷利(Rayleigh)散射定律:

其中λ為入射光波長;I0為入射光強度;Iθ為與入射光成θ角處散射光強度;v為單個粒子尺寸;n為粒子對一定波長光的折射率;n0為粒子存在的溶劑(基質)對一定波長光的折射率;θ為光信號檢測器與入射光的夾角;γ為單位容積內粒子的數目，即待測物濃度[1]。

在生化儀反應體系中 λ、I0、Iθ、n、n0、θ 為常量;γ即抗原(Ag)-抗體(Ab)復合物濃度，為自變量，其大小可通過測定反應體系中的吸光度(A)值來確定。

免疫透射比濁法中Ag與Ab的結合反應為:Ag+Ab→Ag-Ab，反應所形成的Ag-Ab復合物在反應液中是不溶的懸浮顆粒，當光束通過Ag-Ab復合物時發生散射、吸收、折射、反射等一系列光學變化。各種光學作用的大小主要取決于入射光強度、波長、顆粒大小、質地形狀及Ag-Ab復合物的濃度[2]。

影響檢測敏感性和特異性的主要因素有以下2個方面:(1)反應體系中Ag-Ab復合物的濃度和特性;Ab特異性高、親和力強，反應的特異性強;(2)反應體系的基質會影響光散射。

二、測定波長選擇與分析敏感性和特異性的關系

在實際反應中Ag-Ab復合顆粒大小隨著反應進行，與波長比例逐漸加大，透射光所占比例逐漸減小，同時粒子折光率也發生變化。為探討波長與反應進程之間的關系，我們使用首都醫科大學臨床醫學科技中心生產的載脂蛋白A1試劑，在全自動生化儀上選取8個波段進行校準測定，讀取反應A值，測定結果見表1。

表1 不同波長時測定校準品的A值

以上數據表明，不同的入射光波長可以產生相當的吸光梯度，隨著波長的加大A值降低，根據雷利公式，免疫透射比濁法不同于化學反應有特異的吸收波峰，在每個波長都有相應的A值變化。

三、雙波長分析主、副波長在免疫比濁法中的應用原則

在生化儀設定中 ΔA=A主波長－A副波長，一般做以下考慮:取吸收峰對應的波長為主波長，吸收光譜曲線的“波谷”對應的波長為副波長。見圖1。

圖1 免疫比濁法中的主、副波長選擇模式示意圖

反應中顯色產物的吸收峰對應的波長為主波長，而試劑空白(顯色劑)的吸收峰對應的波長為副波長。這樣在反應液中待測物濃度越大，剩余的顯色劑量越小，使主、副波長的A值差距拉大，ΔA增大，提高了檢測敏感性。

免疫透射比濁法中 A主波長與 A副波長變化方向相同，使用A主波長－A副波長反而減小了A值變化，降低了敏感性，所以在免疫透射比濁法中不建議使用副波長。

四、總結

根據免疫透射比濁法的測定原理，在分子測定波長對免疫透射比濁法分析敏感性和特異性影響的基礎上，提出以下幾點波長選擇的原則:(1)合適的波長區間。根據表1血清中常見的內源性大分子物質及其相對分子質量、直徑選擇合適的測定波段。由于干擾物乳糜(CM)在體內半壽期為5～20 min，正常人空腹血中不含CM顆粒，但高脂蛋白血癥Ⅰ型和V型患者空腹血清含有CM顆粒，在CM水解期出現CM顆粒，此時會出現肉眼可見的CM血，同時會干擾生化儀的測定，所以要盡可能選擇對CM樣本有抗干擾能力的試劑;(2)降低波長可提高分析敏感性，增大波長可提高抗干擾能力;(3)可以不使用副波長。

[1]沈 霞.臨床免疫學與免疫學檢驗新技術[M].北京:人民軍醫出版社，2002:22-35.

[2]張惠中.臨床生物化學[M].北京:人民衛生出版社，2009:478-479.