維吾爾族肺腺癌患者的EGFR基因突變分析

單莉 張琰 趙峰 鄭立謀 張國慶

肺癌是世界范圍內常見的癌癥，發病率和死亡率居各癌癥之首。據2010年我國衛生部的統計，肺癌死亡率為30.83/10萬。肺癌已經成為發病率和死亡率第1位的惡性腫瘤，其5年生存率僅為15%[1-3]。表皮生長因子（epidermal growth factor receptor, EGFR）是一種跨細胞膜糖蛋白，屬于受體型酪氨酸激酶，EGFR信號通路在細胞的生長、增殖和分化等生理過程中發揮著重要調節作用。EGFR基因在多種腫瘤中存在突變或過表達，并通過其介導的信號通路調控腫瘤的生長、侵襲、轉移和血管新生[4-6]。以吉非替尼為代表的EGFR酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors, TKIs）靶向藥物在肺癌的治療中顯示出良好的治療效果，然而，該類藥物的治療效果在不同個體間存在很大差異。多項臨床研究[5,7-12]顯示，EGFR基因外顯子18-21突變是導致不同個體間治療效果差異的主要原因。因此，根據EGFR基因突變檢測結果選擇合適的治療對象，對于提高患者治療效果、延長患者的生存期有重要意義。目前，已有的肺癌EGFR突變研究還沒有針對維吾爾族突變率的報道。本研究檢測了68例維吾爾族和70例漢族肺癌患者的EGFR基因，首次報道了維吾爾族肺癌EGFR基因突變率，并對維吾爾族和漢族EGFR基因突變率進行了比較。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集醫院維吾爾族肺腺癌患者石蠟包埋組織標本68例，其中男性39例，女性29例；年齡30歲-75歲，中位年齡52歲。漢族肺腺癌患者石蠟包埋組織標本70例，其中男性49例，女性21例；年齡35歲-79歲，中位年齡57歲。

1.2 標本采集與DNA提取 采用病理石蠟切片樣品，5 μm切片，不少于8片，室溫保存。所用樣品均為病理診斷確定含有腫瘤組織的蠟塊切片，并且保存時間不超過兩年。取石蠟標本組織，用QIAGEN公司核酸提取試劑盒提取（QIAamp? DNA FFPE Tissue Kit，商品號：564074）DNA， 所提DNA溶于Tris-HCl（10 mmol/L, pH8.0），經紫外分光光度計檢測提取質量，并確定濃度，用Tris-HCl溶液（10 mmol/L, pH 8.0）調整DNA濃度到10 ng/μL和2 ng/μL備用。

1.3 實時熒光PCR擴增 采用ARMS （amplification refractory mutation system, ARMS）方法進行PCR擴增，檢測EGFR基因外顯子18、19、20和21突變。用廈門艾德生物醫藥科技公司EGFR基因突變檢測試劑盒（人類EGFR基因21種突變檢測試劑盒）進行檢測，實驗具體操作步驟參照試劑盒說明書進行操作。采用StrataGene MX3000P實時PCR儀進行擴增，每次檢測樣品包括1個陽性質控品、1個NTC對照。如果Ct值為0或Ct值＞30，則實驗結果判為野生型。所述熒光PCR的反應條件：95oC預變性5 min，1個循環；95oC變性25 s，64oC退火20 s，72oC延伸20 s，15個循環；93oC變性25 s，60oC退火35 s，72oC延伸20 s，31個循環。

1.4 統計學分析 采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析，采用χ2和Fisher精確檢驗分析突變差異，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

共檢測138例肺腺癌的樣本，包括68例維吾爾族、70例漢族，共檢測出43例突變，檢測總突變率為31.2%。維吾爾族突變11例，突變率為16.2%，漢族突變32例，突變率為45.7%，以外顯子19和21突變較為多見。維吾爾族EGFR突變率明顯低于我國漢族EGFR突變率（χ2=14.03,P＜0.001），結果見表1，突變比例分析圖見圖1。

在檢測的肺腺癌EGFR基因突變中，突變點包括19-del突變和外顯子21的L858R突變，其中維吾爾族外顯子19-del突變6例，占突變數的54.5%，L858R突變5例，占突變數的45.5%。漢族19-del突變12例，占突變數的37.5%。L858R突變20例，占突變數的62.5%。 維吾爾族外顯子19和外顯子21（L858R）的突變率與漢族外顯子19和外顯子21（L858R）的突變率相比無明顯差異（P=0.48）（表2）。

圖 1 維吾爾族與漢族肺腺癌EGFR基因突變比較Fig 1 Histog ram com parison o f EGFR m u tations betw een Uighu r lung ad enocarcinom a and Han lung adenocarcinom a. EGFR: ep id erm a l g row th factor recep tor.

表 1 維吾爾族與漢族肺腺癌EGFR基因突變統計結果Tab 1 EGFR m u tation com parison betw een Uighu r lung adenocarcinom a and Han lung adenocarcinom a

表 2 EGFR基因外顯子19與外顯子21突變分析Tab 2 The analysis o f EGFR m utations in Exon 19 and Exon 21

3 討論

EGFR屬于表皮生長因子ErbB家族，該家族包括HER1、HER2、HER3和HER4四個成員。EGFR是一種細胞表面膜蛋白受體，由1,186個氨基酸組成，分子量為170 kDa，由三個功能不同的結構域組成，包括胞外區、跨膜區和細胞內的酪氨酸區[13]。當EGFR與其相應的信號分子結合后，受體分子之間會形成二聚體，兩個受體胞內的酪氨酸激酶彼此作用而相互磷酸化，并啟動胞內的級聯信號通路，從而引起細胞內一系列形態學的改變[13-15]。

EGFR基因在多種腫瘤會存在突變或者過表達，并通過其下游信號通路調控腫瘤的生長、增殖和轉移。目前，常用EGFR-TKIs主要包括吉非替尼和厄洛替尼，是治療肺癌最有效的靶向藥物。然而，該類藥物對EGFR突變患者的有效率高達80%以上，而對野生型患者幾乎沒有療效，因此，檢測EGFR的突變情況是肺癌化療預后重要標志物。研究表明，不同人種肺癌的EGFR突變率差異較大，Schm id等[16]和Kris等[17]通過對大量肺癌病例研究發現，高加索人（Caucasian）肺癌EGFR突變率約為7%-17%。Li等[18]通過對202例肺腺癌患者發現，我國漢族人的肺腺癌EGFR突變率為75.3%。Han[19]和Hsu等[20]的研究進一步表明，東亞人的肺腺癌EGFR突變率約為30%-62%。本研究首次對維吾爾族肺腺癌EGFR突變進行檢測，檢測結果表明維吾爾族肺腺癌EGFR突變率為16.2%，其突變率明顯低于我國漢族肺腺癌EGFR突變率，略高于高加索人EGFR突變率。本研究對維吾爾族肺腺癌EGFR突變檢測為臨床醫生提供了重要參考信息，有益于其肺腺癌的個體化治療。

從地域分布來看，漢族人與日本人居源于東亞大陸，高加索人居源于歐洲大陸，維吾爾族人居于歐洲大陸和東亞大陸之間。居源于東亞大陸人肺腺癌EGFR突變率較高，居源于歐洲大陸的人肺腺癌EGFR突變率較低，維吾爾族人所居區域突變率介于兩者之間，肺腺癌EGFR突變率從歐洲大陸到東亞大陸表現出突變率逐漸增大的趨勢。

肺腺癌EGFR基因外顯子19缺失突變是吉非替尼類藥物作用的關鍵靶點，其缺失突變可引起酪氨酸激酶結構域中4個氨基酸殘基的缺失，從而導致EGFR-ATP受體結合域的角度改變，使吉非替尼類藥物更易結合到該位點，通過阻止ATP進入而阻斷EGFR激酶活性[21]。本研究檢測了68例維吾爾族和70例漢族肺腺癌EGFR基因，發現EGFR總突變率為31.2%，維吾爾族的突變率為16.2%，其中外顯子19-del突變的突變率較高，占突變比例的54.5%。在漢族中EGFR突變率為45.7%，其中外顯子19的缺失突變的突變率有12例，占突變比例的37.5%，維吾爾族EGFR基因外顯子19缺失突變的突變率略高于漢族的外顯子19缺失突變的突變率，分析表明維吾爾族肺腺癌EGFR基因外顯子19突變率與漢族外顯子19突變率差異無統計學意義（P=0.48）。

綜上所述，本研究表明維吾爾族肺腺癌患者EGFR基因突變率明顯低于我國漢族EGFR基因突變率。EGFR基因突變與EGFR-TKIs藥物治療敏感性明顯相關，基于EGFR的突變情況來選擇EGFR-TKIs的藥物進行化療已成為臨床醫生的共識，本研究首次提供維吾爾族肺腺癌的EGFR突變率信息，可以為臨床醫生提供有益參考，使廣大肺腺癌患者受益。

Acknowledgement

We thank Qing Shao for great help in statistical analysis,data processing, language revision and fruitful discussions.