重組人血管內皮抑制素聯合貝伐珠單抗體內抑瘤作用的效果及分析

牛牛 李寶蘭 劉朝陽 胡瑛 李雪冰 李杰 史鶴齡 張海清

自20世紀70年代Folkman教授[1]提出腫瘤生長和轉移依賴于腫瘤內部新生血管的觀點后，很多研究一直致力于通過阻斷腫瘤新生血管形成來達到治療腫瘤的目的。抗血管治療近年來隨著靶向治療在腫瘤治療領域的方興未艾，越來越成為臨床治療腫瘤的重要受手段之一。肺癌則是世界上對人類健康威脅最大的一種常見腫瘤，目前世界上每年大約新發肺癌病例約160萬人[2]，而肺癌的治療效果目前仍然很不理想，據報道，美國每年因肺癌死亡人口超過16萬[3]。近年來隨著靶向藥物和抗血管治療藥物進入臨床，延長了肺癌特別是中晚期肺癌患者的生存期。目前在國內外最常見的腫瘤抗血管治療藥物就是貝伐珠單抗和重組人血管內皮抑制素（及其改良制劑）。兩種藥物作用機制各異，雖然有很多體內外實驗都證明兩種藥物有明確的抗腫瘤作用，但是目前尚缺乏在同一個實驗模型和條件下，對兩種藥物實際作用效果的分析的實驗。我們也注意到在國內外的多中心臨床研究中抗血管治療只使用一種藥物，雖然研究結果證明抗血管治療可以延長患者的生存期，但是作用還很有限[4]。本實驗第一次在同一試驗模型下比較重組人血管內皮抑制素和貝伐珠單抗在體內實際的抗腫瘤效果。同時第一次聯合使用兩種抗血管藥物，分析有無聯合用藥的可能性，探索將來腫瘤臨床抗血管治療的新方法和新思路。

1 實驗方法

1.1 主要藥物及實驗材料 重組人血管內皮抑制素注射液（恩度，Endostar），購自山東先聲麥得津生物制藥有限公司。貝伐珠單抗注射液（安維汀，Avastin），購自上海羅氏制藥有限公司。RIPA蛋白抽提試劑盒及BCA蛋白定量試劑盒購自北京賽馳生物科技公司。VEGF兔抗人單克隆抗體（IgG VEGF-A、IgG VEGF-C）抗體購自北京新新通生物科技公司。凝膠分析系統采用復日Smart View生物電泳圖像分析系統。實驗動物：Balb/c裸鼠（16 g-18 g，SPF級）中國藥品生物制品檢定所實驗動物中心提供（實驗動物質量合格證號SCXK（京）2009-0017）。人肺腺癌A549細胞株，由D.J. Giard等建株，中國醫學科學院腫瘤研究所提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 體外細胞培養 A549細胞常規培養于含10%胎牛血清、100 U/m L青霉素、100 U/m L鏈霉素的DMEM培養基中，置37oC、飽和濕度、5%CO2的培養箱中培養，2天傳代一次，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2 體內動物實驗 取經體外細胞培養已在裸鼠皮下傳代生長良好的移植性肺腺癌腫瘤結節，無菌操作制成瘤細胞小塊，用穿刺針接種于Balb/c裸鼠腋窩皮下，1塊/鼠（約2 mm3）。將動物隨機分為4組，每組6只，稱體重標號。4組分別為模型對照組（control group, CG）、重組人血管內皮抑制素（3 mg/kg）組（Endostatin group, EG）、貝伐珠單抗（5 mg/kg）（Bevacizumab group, BG）組、重組人血管內皮抑制素（3 mg/kg）聯合貝伐珠單抗（5 mg/kg）（combining group, COG）組。各組在接種腫瘤后第15日開始皮下瘤周給藥，重組人血管內皮抑制素每天1次，連續16天，共16次。貝伐珠單抗每周2次（周一、周二給藥），共6次。模型對照組使用0.9%無菌氯化鈉液（5 m L/kg）每日瘤周注射，共16次。重組人血管內皮抑制素（3 mg/kg）、 貝伐珠單抗（5 mg/kg）聯合用組給藥方式同單獨給藥組。裸鼠飼養室擁有IVC-II型（智能型）獨立送風隔離籠具，室溫20oC-22oC，相對濕度40%-60%（實驗動物使用許可證號SYXK(京)2008-0025）。裸鼠食用滅菌裸鼠飼料，SPF級，中國醫學科學院實驗動物研究所產品（許可證號SCXK(京)2009-0008），執行標準GB14924.3-2001。實驗開始后每4天用卡尺測一次皮下腫瘤體積，每次給藥結束后觀察荷瘤鼠表現，于腫瘤接種后第31天處死動物，完整剖取瘤結并稱瘤重和體重，計算相對腫瘤增殖率。

1.2.3 Western blot實驗 將腫瘤標本用含有蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白抽提試劑盒裂解，而后于冰上孵育20 m in，4oC離心（13,000 rpm, 20 m in）。離心完成后取上清經BCA蛋白質濃度測定試劑盒進行蛋白質濃度測定。10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，然后轉至固相載體（NC膜）上。10%牛奶封閉非特異抗原，加入一抗（兔抗人VEGF-A/C單克隆抗體）4oC反應過夜，常溫洗膜后加入二抗，室溫反應1 h。用Pierce公司的Supersignal West Dura Extended Duration Substrate ECL化學發光系統進行檢測，將A液與B液等體積混合，配成發光劑，滴在保鮮膜上，將NC膜倒扣于其上，5 min后用另一保鮮膜將NC膜包裹，X線片壓片，曝光20 s-5 min，顯影2 min，定影2 min。Western blot結果掃描儲存。 用復日Smart View生物電泳圖像分析系統分析結果。

1.2.4 藥效判定標準：

腫瘤體積（V）= 腫瘤長徑（L）×腫瘤短徑（S）2/2

按以下公式計算相對腫瘤體積（RTV）和相對腫瘤增殖率T/C%：RTV=Vt/V0

Vt：測量腫瘤得到的瘤體積

V0：初始瘤體積（給藥前）

T/C%=給藥組的RTV平均值/對照組的RTV平均值×100%

公式中EA為A藥抑瘤率，EB為B藥抑瘤率，EAB為兩藥合用抑瘤率，q=0.85-1.15為兩藥合用作用相加，q＞1.15為兩藥合用作用增強，q＜0.85為兩藥合用作用拮抗[5]。

Western blot結果分析：采用凝膠圖像分析系統，對電泳條帶進行密度掃描后進行灰度分析（Smart View生物電泳圖像分析系統）。

1.2.5 統計方法 統計數據處理均采用SPSS 13.0軟件系統處理，動物實驗結果所有數據以Mean±SD表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 動物實驗結果 實驗共計31天，實驗結束時重組人血管內皮抑制素（3 mg/kg）聯合貝伐珠單抗（5 mg/kg）組抑瘤率為64.15%，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01），重組人血管內皮抑制素單藥組（3 m g/kg）抑瘤率為38.68%，貝伐珠單抗單藥組（5 mg/kg）抑瘤率為52.36%。重組人血管內皮抑制素、貝伐珠單抗聯合用藥Q值為0.906，提示兩藥聯合使用作用相加。實驗結束，各治療組動物與對照組比較，體重無明顯差異，動物活動正常未表現毒性反應。表1顯示各組實驗動物基本情況和實驗數據。給藥期間腫瘤生長曲線見圖1。實驗結束時各組瘤重圖見圖2。實驗結束時的腫瘤組織瘤結照片見圖3。

2.2 Western blot實驗結果 對Western blot電泳結果分析：貝伐珠單抗組VEGF-A表達較對照組明顯減少，抑制率為60.8%。重組人血管內皮抑制素組VEGF-A（圖4）、VEGF-C（圖5）表達較對照組亦有減少，抑制率分別為14.6%、30.3%。重組人血管內皮抑制素聯合貝伐珠單抗組VEGF-A、VEGF-C表達較對照組抑制最為顯著，抑制率為79.7%、44.2%。β-Actin表達在各組中無明顯差異。

圖 1 各組間腫瘤體積生長情況分析(棕色曲線：對照組平均種瘤體積（347.27±3.51）mm 3；紅色曲線：重組人血管內皮抑制素治療（198.29±2.13）mm 3；綠色曲線：貝伐珠單抗治療組（143.57±2.82）mm 3；藍色曲線：聯合用藥組（117.63±1.93）mm 3。各組較對照組相比均有統計學差異，P＜0.01)。Fig 1 Tum o r su rv iva l tim e a fte r adm in istra tion o f end ostatin o r com bined w ith bevacizum ab on nude m ice bearing A549. Brow n line:con tro l g roup: (347.27±3.51) mm 3; Red line: endostatin g roup: (198.29±2.13) mm 3; Green line: bevacizum ab g roup: (143.57±2.82) mm 3; b lue line: com b in ing g roup: (117.63±1.93) mm 3. Com pared w ith con tro l g roup, P＜0.01).

圖 2 各組間抑瘤效果分析。黑色柱：對照組腫瘤平均重量（0.35±0.06）g；紅色柱：重組人血管內皮抑制素治療組腫瘤平均重量（0.22±0.10）g，抑瘤率：38.68%；綠色柱：貝伐珠單抗治療組腫瘤平均重量（0.17±0.07）g，抑瘤率：52.36%；藍色柱：聯合治療組腫瘤平均重量（0.13±0.07）g，抑瘤率：64.15%。各組較對照組相比均有顯著差異，P＜0.01）。Fig 2 Inh ib itive effect o f endostatin com b ined w ith bevacizum ab on nude m ice bearing A549. Black co lum n: con tro l g roup, TW: (0.35±0.06) g; Red co lum n: endostatin co lum n, TW: (0.22±0.10) g, TIR:38.68%; Green co lum n: bevacizum ab co lum n, TW: (0.17±0.07) g,TIR: 52.36%; Blue co lum n: com b ining g roup, TW: (0.13±0.07) g, TIR:64.15%. Com pared w ith con tro l g roup, P＜0.01).

表 1 動物實驗基本情況Tab 1 Basic in form ation about the experim ent

圖 3 瘤體切除后照片Fig 3 Ph o to g rap h o f En d o sta tin com b in ed w ith bevacizum ab on nude m ice bearing transp lanted tum or A549

圖 4 Western b lo t檢測各組中VEGF-A蛋白的表達。泳道1、2：對照組；泳道3、4：貝伐珠單抗組，抑制率60.8%；泳道5、6：重組人血管內皮抑制素治療組，抑制率14.6%；泳道7、8：聯合治療組，抑制率79.7%。實驗數據均采用復日sm art view生物電泳圖像分析系統處理。Fig 4 Western b lo t analysis fo r VEGF-A p ro tein exp ression. Line 1, 2: con tro l group; Line 3, 4: bevacizum ab g roup/inhibition rate (IR): 60.8%; Line 5, 6:endostatin group/IR: 14.6%; Line 7, 8: com bining group/IR: 79.7%. All date w as analyzed by sm art view system and com pared w ith control group.

圖 5 Western b lot檢測各組中VEGF-C蛋白的表達。泳道1、2：對照組；泳道3、4：貝伐珠單抗組，較對照組無明顯改變；泳道5、6：重組人血管內皮抑制素治療組抑制率30.3%；泳道7、8：聯合治療組，抑制率44.2%。實驗數據均采用復日Sm art View生物電泳圖像分析系統處理。Fig 5 Western b lo t analysis fo r VEGF-C p ro tein exp ression. Line 1, 2: con tro l g roup; Line 3, 4: bevacizum ab g roup, no d ifference w ith con tro l g roup; Line 5, 6: endostatin g roup/IR: 30.3%; Line 7, 8: com bining g roup/IR: 44.2%. All date w as analyzed by Sm art View system and com pared w ith contro l group.

3 討論

3.1 重組人血管內皮抑制素和貝伐珠單抗的相互作用 通過實驗我們發現重組人血管內皮抑制素和貝伐珠單抗在體內實驗均表現出了一定的抑制腫瘤生長的能力，貝伐珠單抗抑制腫瘤生長的能力更強（52.36% vs 38.68%）。聯合使用兩種藥物則效果更為明顯（64.15%）。貝伐珠單抗是一個作用機制明確的單克隆抗體藥物。其為一個人源化的VEGF單克隆IgG抗體，通過與循環VEGF-A結合，阻止其與內皮細胞表面相應的VEGF受體結合達到抗腫瘤新生血管之作用[6,7]。而重組人血管內皮抑制素自1997年O' Reilly等[8]從小鼠血管內皮細胞瘤的培養上清液中分離發現以后，雖然在眾多體內外實驗中均發現有明顯的抑制腫瘤新生血管形成的作用，但具體作用機制至今仍然未明確。Tan等[9]研究發現重組人血管內皮抑制素處于腫瘤新生血管調節網絡中的關鍵部位，能夠下調多種促血管形成因子的表達如血管內皮生長因子、成纖維細胞生長因子、表皮生長因子受體等，同時能上調多種抗腫瘤血管形成因子的表達，如血小板反應蛋白1、酪氨酸蛋白激酶B3抗體等。Dhanabal等[10,11]研究發現重組人血管內皮抑制素可能增加血管內皮細胞的凋亡，改變血管內皮細胞的細胞周期。Marko等[12]發現固定的重組人血管內皮抑制素促進內皮細胞存活，而可溶性的重組人血管內皮抑制素則促進其凋亡。Nicholas等[13]發現重組人血管內皮抑制素可破壞肌球蛋白微絲結構的完整性，導致內皮細胞運動能力下降。Kim等[14]研究發現重組人血管內皮抑制素的部分抗腫瘤活性是通過調節基質金屬蛋白酶實現的，雖然相關研究很多，但目前尚難就重組人血管內皮抑制素抑制腫瘤新生血管形成的確切機制達成共識。本實驗發現重組人血管內皮抑制素和貝伐珠單抗聯合使用，藥效上有相加作用（Q: 0.969），最近一些研究也表明重組人血管內皮抑制素的部分抗血管生成作用也是通過影響VEGF表達來實現的。Huang等[15]發現血管內皮生長因子可促進細胞核內的核仁素遷徙到細胞表面，而用抗體封閉等技術，降低細胞表面表達的核仁素，可以明顯降低內皮細胞的遷徙能力，防止新生脈管的形成。Song等[16]和Zhou等[17]都通過研究也發現核仁素也是重組人血管內皮抑制素發揮抗腫瘤血管和淋巴管生成的重要受體。這些研究表明兩種藥物在作用機制上的確存在著交集。在本實驗中兩者表現出作用相加效果，但其具體機制還需要更多的研究才能明確。

3.2 對淋巴管和血管的抑制作用 通過Western blot實驗結果我們可以看出在體內貝伐珠單抗對VEGF-A的抑制作用明顯強于重組人血管內皮抑制素（60.8% vs 14.6%），而重組人血管內皮抑制素對VEGF-C則有一定的抑制作用（30.3%）。貝伐珠單抗相對于對照組沒有表現出對VEGF-C的抑制作用。這也與貝伐珠單抗是個單一的VEGF-A的單克隆抗體對VEGF-C沒有作用有關。眾所周知 VEGF-C于淋巴管的形成關系密切，而重組人血管內皮抑制素對淋巴管的抑制作用，相關研究也有類似報道[18]。聯合用藥組的實驗結果發現無論是對于VEGF-A還是VEGF-C均表現出了較強的抑制作用（79.4% vs 44.2%），這也與物實驗中各組移植瘤抑瘤率的差異相吻合。我們發現雖然貝伐珠單抗本身對VEGF-C沒有直接作用，但是聯合使用后，聯合用藥組VEGF-C的抑制效果卻較單獨使用重組人血管內皮抑制素更好，與之類似，Véronique Mathieu[19]發現在膠質母細胞瘤動物模型中，聯合使用貝伐珠單抗和替莫唑胺能夠增強后者的抗腫瘤血管生成的作用。但必須強調的是：本實驗也僅僅發是現了這一現象，并不能由此即做出貝伐珠單抗能增強重組人血管內皮抑制素抑制淋巴管形成作用的推斷。由于腫瘤的脈管調節機制是一個巨大而復雜的網絡，目前人類還很難全面了解，所以具體的作用機制還需要更多的研究才能明確。

4 結論

通過本實驗我們發現了兩種抗血管治療藥物在動物體內抗腫瘤作用的差異，同時也發現兩者聯合使用有相加作用。腫瘤的血管和淋巴管生成是一個復雜的調控網絡，本實驗的重要性在于第一次在同一個試驗模型下對兩種常用的抗腫瘤血管生成的藥物療效進行了分析，第一次發現了兩種藥物聯合使用后效果較單獨用藥更顯著，存在相加作用。而動物實驗中也并未發現有實驗動物因為聯合用藥出現嚴重致死的毒副反應。這為以后進一步通過這些現象了解腫瘤脈管形成的復雜調節網絡提供了一個新的切入點，也為臨床進一步改善抗血管治療的效果提供了新的思路。