應用生物發光技術研究甲基硒酸對L9981-Luc肺癌細胞株移植瘤模型生長轉移的影響

任苑蓉 王玉麗 劉紅雨 閆惠琴 陳軍 侯梅 李為民 范亞光 周清華

硒作為一種人體必需的微量元素和天然的防癌抑癌制劑，越來越受到腫瘤學界的關注。甲基硒酸（methylseleninic acid, MSA）是一種新型的人工合成的硒化合物，以其廣泛的抗癌效應和無需體內代謝酶轉化而直接作用于靶細胞的特性成為最具潛力的硒化合物抗癌制劑[1]。為進一步探明MSA對腫瘤的抑制作用，本研究應用精諾真活體動物可見光成像系統（IVIS imaging system 200 Series），研究了MSA對肺癌細胞株L9981-Luc裸鼠移植瘤的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗細胞株L9981-Luc，由天津市肺癌轉移與腫瘤微環境重點實驗室提供，已經證明其在體內外均能持續穩定地表達熒光素酶基因，且發光值和細胞數成明顯直線相關[2]。甲基硒酸由美國加利福尼亞大學Allen C. Gao教授（Department of Urology and Cancer Center, UC Davis School of Medicine, Sacramento, CA）提供。順鉑（DDP）購自齊魯制藥有限公司（批號：030801）。實驗動物采用BALB/c裸鼠，購自北京維通利華動物飼養有限公司，雌性，6周齡，質量為18 g-20 g。

Artagain黑紙（Strathmore, Catalog445-109）；注射器、鑷子、手術剪；熒光素（Luciferin）購自上海睿星基因技術有限公司；麻醉劑異氟烷（isoflurane）24孔板，Greiner公司產品；RPM I-1640培養基、新生小牛血清購自GIBCO公司；精諾真活體動物可見光成像系統（IVIS imaging system 200 Series）型號：IVIS200，美國Xenogen Corporation產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和接種 L9981-Luc細胞株在含10%的小牛血清及PRM I-1640培養液中培養，傳代擴增，收集對數生長期細胞制備懸液，調整每組細胞濃度為1×107個/m L；臺盼藍染色計數活細胞占95%以上。SPF環境下進行實驗操作，每只裸鼠右后腿腹股溝處皮下接種細胞懸液0.1 mL/只。

1.2.2 溶液配制方法 稱取10 mg甲基硒酸，加入5 m L生理鹽水，配成2 mg/m L甲基硒酸溶液，從其中取2 m L，加入14 m L生理鹽水，即配成0.25 mg/mL甲基硒酸溶液；將4 mg/m L的順鉑溶液稀釋10倍，即配制成0.4 mg/m L的順鉑溶液。

1.2.3 實驗分組 6周齡裸鼠，體重約16 g-18 g，共15只，隨機分為3組，每組5只，接種第3天開始給藥：對照組每日腹腔注射生理鹽水0.2 m L，連續14天；甲基硒酸組每日每只腹腔注射甲基硒酸溶液50 μg（0.2 m L），連續14天；順鉑組每周每只腹腔注射順鉑4 mg/kg。

1.2.4 抑瘤率的計算

1.3 統計學處理 采用SPSS 11.0統計軟件。本組實驗數據為計量資料，采用方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同藥物處理組不同時間L9981-Luc原位瘤發光強度的比較（圖1） 皮下接種L9981-Luc肺癌細胞株的熒光信號在接種后逐漸增強。接種后第7天，所有裸鼠接種部位皮下均可探測到1×105-1×106數量級的信號強度，隨時間增加，原發瘤和胸部轉移信號均同步增加（圖2）。接種后第0-14天，不同組人高轉移大細胞肺癌細胞株L9981-Luc移植瘤在裸鼠體內發光強度無統計學差異（表1）；用藥第21天，不同組間移植瘤發光值比較差異有統計學意義（P=0.002）（表2）；兩兩比較：對照組發光值顯著高于順鉑組（P=0.001），對照組發光值顯著高于甲基硒酸組（P=0.031），甲基硒酸和順鉑組間比較，差異無統計學意義（P=0.147）。MSA組抑瘤率為25.20%，DDP組67.29%（圖3）。

表 1 0-14天不同藥物處理組L9981-Luc原位瘤發光強度的比較（Mean±SD）Tab 1 Com parison o f the bio lum inescence (p/s) o f p rim ary tum o r o f L9981-Luc treated w ith d ifferen t d rugs d0-d14 (Mean±SD)

圖 1 不同藥物處理組和不同時間組間人高轉移大細胞肺癌細胞株L9981-Luc原位移植瘤發光強度比較Fig 1 Com parison o f p lan ted tum o r g row th o f L9981-Luc treated w ith d ifferent d rugs in nude m ice

圖 2 與MSA組比較，對照組活體內移植瘤和轉移瘤信號值隨時間遞進而逐漸增強Fig 2 Com pared w ith MSA group, bio lum inescence o f p rim ary tum or and m etastases in the thoracic area in the contro l g roup w as gradually increased as tim e increased

圖 3 分別在第7、14、21天測量各藥物處理組各只裸鼠移植瘤發光信號值，計算平均值，兩兩比較，對照組明顯高于順鉑和甲基硒酸組（P＜0.001)，甲基硒酸組明顯高于順鉑組（第21天，P＜0.05）。Fig 3 Measure the m ean bio lum inescence (p/s) of p rim ary p lan ted tum o r on d7, d14, d21. The m ean bio lum inescence o f the p lan ted tum or in con tro l group w as rem arkab ly higher than that in the DDP g roup and MSA group (P＜0.001), MSA g roup w as rem arkab ly h igher than that in con tro l g roup on d21 (P＜0.05).

表 2 第21天不同藥物處理組L9981-Luc原位瘤發光強度的比較（Mean±SD）Tab 2 Com parison o f the p rim ary tum o r bio lum inescence (p/s) o f L9981-Luc treated w ith d ifferen t d rugs on d21 (Mean±SD )

2.2 不同藥物處理組間L9981-Luc移植瘤肺轉移情況的比較 于接種后第7天開始觀察到不同藥物處理組胸部轉移信號，發光值隨時間逐漸增強，分別在d7、d14、d21測量各藥物處理組各只裸鼠胸部轉移信號值（圖4），計算平均值，對照組發光值明顯高于順鉑和甲基硒酸組，甲基硒酸組高于順鉑組（P＞0.05）。MSA組抑瘤率為17.14%，DDP組為48.30%（表3，圖5）。

2.3 各組裸鼠體重改變的比較 對照組裸鼠體重平均增加2.10 g，體重增加率為12.6%，甲基硒酸組平均體重增加2.10 g，體重增加率為11.9%，順鉑組平均體重變化為-0.64 g，變化率為-3.59%，不同藥物處理組間裸鼠體重增加差異有統計學意義（P=0.038）；兩兩比較，對照組裸鼠體重增加值明顯高于順鉑組（P=0.029），甲基硒酸組裸鼠體重增加值明顯高于順鉑組（P=0.034）（表4）。

圖 4 分別在第7、 14、21天測量各藥物處理組裸鼠胸部轉移信號值，計算平均發光值，對照組明顯高于順鉑和甲基硒酸組（P＜0.001），甲基硒酸組高于順鉑組（P＞0.05）。Fig 4 Measu re the m ean bio lum inescence (p/s) o f m etastases in the tho racic area on d7, d14, d21. The m ean b io lum inescence o f the m etastases in contro l group w as rem arkab ly higher than that in the DDP g roup and MSA g roup (P＜0.001), MSA g roup w as rem arkab ly higher than that in con tro l g roup (P＞0.05).

表 3 不同藥物處理組間L9981-Luc胸部轉移信號發光強度的比較（Mean±SD）Tab 3 Com parison o f the m ean bio lum inescence (p/s) o f thoracic area m etastases o f L9981-Luc treated w ith d ifferen t d rugs over tim e (Mean±SD)

表 4 用藥前后各組小鼠體重變化情況（Mean±SD）Tab 4 The w eigh t change befo re and after d rug use (Mean±SD)

圖 5 不同藥物處理組和不同時間人高轉移大細胞肺癌細胞株L9981-Luc在裸鼠胸部轉移瘤生長的組間比較Fig 5 Com parison o f m etastatic tum o r g row th o f L9981-Luc p lan ted tum or treated w ith different d rugs in nude m ice

3 討論

本研究將帶有熒光素酶基因（Luc）的質粒PGL4.17經陽離子脂質體介導轉入人高轉移大細胞肺癌細胞株L9981中，反復傳代培養，篩選出高效穩定表達熒光素酶的細胞株L9981-Luc。該細胞株能在體內外高效、持續穩定地表達熒光素酶基因；細胞株發光值和細胞數目呈直線線性關系（R2=0.973）； L9981-Luc細胞株在小鼠體內具有高成瘤和高轉移特性，應用精諾真活體動物可見光成像系統（IVIS imaging system 200 Series）能直觀地觀察活體內原發瘤和轉移瘤的情況；原發瘤重量和發光值呈直線線性關系（R2=0.900）[2]。IVIS系統具有高靈敏度，與傳統方法相比，在肉眼尚不能發現腫瘤的時候即可使用該方法觀察、量化活體內腫瘤細胞的生長，因此在早期即可開始對動物皮下自發轉移模型進行藥物處理。生物發光反映的是具有代謝活力細胞的數量，與通過測量腫瘤體積判斷腫瘤細胞負荷的方法相比，避免了腫瘤周邊水腫、腫瘤組織內壞死細胞和組織的干擾，更有效的反映了藥物對腫瘤細胞生物學特性的影響。

硒是人類和哺乳動物必需的微量元素，許多流行病學資料和一些臨床試驗已初步證明超營養水平的硒攝入量對于包括食道癌、胃癌、結腸癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌及肺癌等各系統腫瘤的發生具有預防作用[3-5]。劉潔薇等[6]在體外應用甲基硒酸處理L9981細胞株，觀察到甲基硒酸可明顯抑制人高轉移大細胞肺癌細胞株L9981的體外增殖和克隆形成能力，并誘導細胞凋亡；同時可明顯上調Fas、FasL、 Bax、 p21、 p53和cyclinD1基因表達水平。本研究觀察到在活體動物體內，甲基硒酸對L9981-Luc細胞的原發瘤生長有明顯的抑制作用，差異具有統計學意義，對甲基硒酸抗腫瘤作用的研究做了重要補充。本研究同時觀察到在裸鼠體內，甲基硒酸具有抑制肺癌細胞株L9981-Luc移植瘤肺轉移的趨勢，但其確切機理有待進一步研究。通過各組裸鼠體重的觀察比較，觀察到50 μg甲基硒酸毒性小于順鉑的毒性作用，甲基硒酸組可較好的耐受，兩者聯合應用是否可以增加療效有待進一步研究。

硒化合物抑制腫瘤生長及轉移的機制可能與其抑制腫瘤血管生成、誘導細胞凋亡、抗腫瘤侵襲轉移能力等有關[7]，有可能成為新的肺癌化療的輔助治療手段，有待于進一步研究。