微轉移在非小細胞肺癌的預后價值

雷源源 綜述 吳一龍 審校

肺癌是我國目前發病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1]。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占肺癌的80%-85%，分子靶點的發現及相應靶向藥物的臨床應用進一步開辟了NSCLC個體化治療的時代，但總體上NSCLC的5年生存率仍滯留在15%-20%左右。完全性切除的I期NSCLC，常規臨床方法檢測不到殘余腫瘤細胞的患者中仍有25%-30%患者最終會發生局部復發或遠處轉移[2,3]，這可能與肺癌患者早期即存在全身微轉移有關。這些微轉移灶存在于外周血、骨髓、淋巴結或漿膜腔中，在一定條件下增殖浸潤，引起腫瘤復發、轉移。NSCLC的微轉移主要包括淋巴結微轉移、骨髓腔微轉移、胸膜腔微轉移及外周血微轉移。分子生物學技術的發展將微轉移的檢測能力提高到了細胞和分子水平，也使檢測NSCLC微轉移灶用于預測療效和判定預后成為可能。

1 微轉移的概念

1869年，Ashworth首先報道了在1例腫瘤患者體內檢測到循環腫瘤細胞（circulating tumor cells, CTCs）。腫瘤的微轉移（mircrometastasis）或隱匿性轉移（occult metastasis）是指惡性腫瘤在發展過程中，癌細胞播散并存活在淋巴結、骨髓、外周血及各組織器官中，但尚未形成顯性轉移灶，轉移部位也無任何臨床表現，采用影像學和常規病理方法難以檢測到的微量轉移，需要通過分子生物學的技術予以診斷[4]。

2 NSCLC微轉移的檢測方法

2.1 免疫組織化學法（immunohistochemistry, IHC） IHC是利用抗原與抗體間的特異性結合原理和特殊的標記技術，對組織和細胞內的特定抗原或抗體進行定位、定性或定量檢測的一門技術。IHC主要用于NSCLC淋巴結及骨髓中微轉移灶的檢測。IHC常用的單克隆抗體主要是抗上皮來源的蛋白，如抗上皮細胞粘附分子（EpCAM）抗體Ber-Ep4、抗細胞角蛋白家族（CK）抗體AE1/AE3。IHC診斷NSCLC微轉移具有較高的敏感性，可達10-5-10-6，而且檢測方法簡便；缺點是由于酶染色和非特異性抗原的表達而導致特異性較低。

2.2 聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction, PCR）PCR是體外酶促合成、擴增特異基因片段的一種方法，它能使目標DNA片段呈指數擴增。目前在淋巴結微轉移檢測中應用較多的是逆轉錄PCR，它是以腫瘤組織特異性表達的mRNA為分子標記，先合成cDNA后再進行PCR擴增，通過檢測腫瘤標志物mRNA來反應腫瘤細胞的存在。熒光實時定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR）是在PCR反應體系中加入熒光基因，利用熒光信號累積實時監測整個PCR過程，通過加入已知濃度的標準樣品繪制的標準曲線，能推算出樣品中初始模板的濃度，可定性、定量的檢測微量腫瘤細胞。熒光實時定量PCR是目前最敏感的檢測方法[5]，敏感性可達10-7，與逆轉錄PCR相比，它可以用正常組織作對照來設定合理的cut-off值，在一定程度上減少了假陽性率。PCR主要用于檢測NSCLC淋巴結、骨髓及外周血中的微轉移灶，常用的分子標志物有細胞角蛋白家族（CKs）、黏蛋白-1（mucin1, MUC1）、LUNX（lung-specific x gene）、CEA、p53、Kras、端粒酶逆轉酶（human telomerase reverse transcriptase, hTERT）和肺泡表面蛋白。

2.3 流式細胞術（flow cytometry, FCM） 流式細胞術也稱熒光激活細胞分離術，采用熒光標記相應抗體來檢測骨髓和外周血中的腫瘤細胞。其優點是操作簡單、快速、數據精確。缺點是FCM不能提供細胞形態方面的信息，無法區分帶有同樣標志物的腫瘤細胞和正常細胞。FCM常用于骨髓及外周血中腫瘤細胞的檢測。FCM檢測靶細胞的敏感度僅為10-5，在使用時很大程度上依賴于可分析的細胞數目，因此極大地限制了其廣泛應用。

2.4 CellSearch系統 CellSearch系統集免疫磁珠富集技術和免疫熒光技術于一體，先將細胞富集后再進行自動化檢測，其生物學原理是依據腫瘤細胞與正常細胞表達的表面蛋白不同將二者區分開來。來源于中胚層的白細胞表達CD45，來源于外胚層的癌細胞表達上皮細胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecule, EpCAM）和細胞角蛋白（cytokeratin, CK），但不表達CD45。該系統首先利用免疫磁珠技術將EpCAM標記的CTCs從血液樣本中富集出來，然后加入熒光抗體標記和化學染色來準確識別CTCs，系統將“EpCAM+CK+DAPI+CD45-”的細胞界定為CTCs。CellSearch系統可以檢測7.5 mL血液樣品（約含400多億的血細胞）中單一的CTCs，是目前自動化程度最高的CTCs檢測技術，且受人為因素影響較小，具有較高的特異性、敏感性及可重復性[6]，該系統是目前唯一被美國食品藥品監督管理局（FDA）批準用于轉移性乳腺癌、結直腸癌和前列腺癌 CTCs檢測的新技術[7-9]。近年來，應用該系統檢測肺癌及其他實體瘤CTCs的研究也越來越受重視。但該檢測系統會遺漏缺失上皮細胞表面標志的腫瘤細胞，例如經過上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）后的細胞，而且檢測費用較高，限制了其在臨床上廣泛應用。

2.5 其他方法 蛋白免疫印跡（Western blot or Immunoblotting），是根據抗原抗體的特異性結合檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法，現已成為蛋白分析的一種常規技術，具有分辨率高、特異性強和敏感度高等優點。目前該方法在微轉移檢測上應用較少，Chen等[10]曾報道使用Western blot檢測NSCLC淋巴結微轉移。此外，也有研究應用基因表達譜技術[11]和蛋白質組學技術[12]檢測NSCLC淋巴結微轉移。

3 微轉移與NSCLC預后

3.1 淋巴結微轉移與NSCLC預后 淋巴結是否受累是包括NSCLC在內的多數實體瘤術后無瘤生存期（disease free survival, DFS）和總生存期（overall survival, OS）的重要預測因子。應用IHC或逆轉錄PCR對常規病理方法檢查陰性的淋巴結進行微轉移檢測，有助于對患者進行更準確的“分子分期”，在預測復發和評估預后上均有著重要意義，同時能夠為制定多學科綜合治療方案提供更準確的依據。周清華等[13]的研究通過對比常規病理組織學方法和逆轉錄PCR診斷肺癌微轉移，證實逆轉錄PCR敏感性更強，靈敏度更高，能提高淋巴結和循環系統微轉移的檢出率。楊浩賢等[14]用逆轉錄PCR方法檢測淋巴結中LUNX mRNA的表達，也證實NSCLC患者的縱隔淋巴結中，有常規病理學無法診斷的微轉移灶存在。

Kubuschok等[15]報道，用IHC檢測127例患者的淋巴結微轉移，檢出25例患者存在淋巴結微轉移，隨訪64個月，發現檢測出微轉移的患者其腫瘤復發率較無微轉移者高出2.7倍，OS風險比HR=2.5。Le Pimpec-Barthes等[16]用逆轉錄PCR的檢測淋巴結中CK19 mRNA。在未發生微轉移的患者，術后2年生存率為100%，而伴有微轉移的患者，2年生存率僅為64.5%，差異有統計學意義（P=0.04）。歐陽偉煒等[17]應用IHC檢測78例I期NSCLC根治術后區域淋巴結的微轉移，并評估淋巴結微轉移與患者長期生存的關系。淋巴結微轉移檢出率為26.9%（21/78），伴有微轉移的患者中位生存期為23個月，不伴有微轉移的患者為87個月，差異有統計學意義（P=0.008）。

迄今，檢測淋巴結微轉移最大樣本量的前瞻性臨床試驗ACOSOG Z0040[18]的研究結果再次證實了淋巴結微轉移的預后價值。經HE染色確認為N0的NSCLC患者中，淋巴結微轉移組與未發生微轉移組相比，術后DFS（HR=1.63, P=0.009）和OS（HR=1.59, P=0.007）均有統計學差異。然而發生微轉移的淋巴結數目及淋巴結站與患者OS無相關性。多變量分析顯示，淋巴結微轉移是預后的獨立危險因素。

綜合分析（表1），雖然有少數研究[19-21]未證實淋巴結微轉移與不良預后有明確關系，但大量研究表明淋巴結微轉移是NSCLC患者預后的獨立危險因素。在今后的臨床實踐中，我們可以考慮通過檢測淋巴結微轉移，對患者進行危險因素分層，復發風險高的患者可進行術后的輔助治療[22]。

3.2 骨髓微轉移與NSCLC預后 骨髓組織內存在大量網狀結締組織，可以對血流中的癌細胞起過濾作用，釋放入血的癌細胞經過骨髓即被濾下，理論上骨髓中的彌散腫瘤細胞（disseminated tumour cells，DTCs）是比較理想的微轉移檢測指標。

表1 探討淋巴結微轉移預后作用的主要臨床研究Tab 1 Major clinical studies of the prognostic value of lymph node micrometastasis

目前，骨髓微轉移檢測的取材部位主要是肋骨和髂骨，有研究比較了兩個部位微轉移的檢出率，證實肋骨的檢出率更高[23,24]。骨髓微轉移的發生率與NSCLC的TNM分期無關[24-26]。

關于骨髓微轉移的預后價值，各研究結果互為矛盾（表2），究其原因在于研究方法的不統一和研究例數不足，且大部分研究未設計正常對照組。ACOSOG Z0040[18]研究顯示，骨髓微轉移發生與淋巴結微轉移無關，患者的預后與骨髓微轉移發生無相關性。至此，我們不禁產生一個疑問：骨髓腔中的DTCs是真的轉移灶，還是僅僅是我們看到的一個表象呢？很多假設試圖解釋這一現象，Osaki等[27]檢測了同一批患者的淋巴結和骨髓微轉移，發現這兩個部位微轉移之間沒有相關性，這可能與不同部位微轉移的發生的機制不同有關；也有觀點認為，骨髓腔的DTCs大部分處于休眠期，這些休眠細胞要活化并形成顯性轉移灶，需要轉移部位微環境、DTCs自身突變和患者遺傳特性三者的綜合作用[28]。目前，骨髓微轉移的預后價值尚無定論。

3.3 胸膜腔微轉移與NSCLC預后 胸膜腔微轉移可能是造成 NSCLC患者術后并發惡性胸腔積液及腫瘤復發的直接原因。通過胸腔灌洗液細胞學（pleural lavage cytology,PLC）檢查來評價胸膜腔微轉移的研究已經進行了半個世紀[29-31]，但大多數研究樣本量小，預后價值尚不明確。

為了明確胸膜腔微轉移的預后價值，國際胸腔灌洗液細胞學研究者聯盟初篩了目前已經發表研究結果31篇相關論文，最終共有8,736例患者被納入meta分析，511（5.8%）例患者PLC陽性。與PLC陰性患者相比，PLC陽性者預后更差，風險比HR=1.465（95%CI: 1.290-1.665;P＜0.001）。PLC陽性是預后的獨立危險因素[32]。Srdjan Saso等[33]認為術前PLC陽性是患者術后發生胸膜、遠處及全身復發的預測因子，同時PLC陽性預示著NSCLC患者尤其是I期NSCLC患者預后更差。基于以上假設，他們篩選了2011年以前收錄在Medline、EMBASE和Google Scholar三個數據庫的相關研究，最終共4,450例患者被納入分析。結果顯示，術前PLC陽性患者與陰性患者相比，胸膜、遠處及全身復發的風險更高（OR=4.82, 95%CI: 2.45-9.51），隨訪顯示，PLC陽性組與陰性組相比，OS風險比HR=2.08（95%CI:1.71-2.52, P＜0.000,01）。單獨分析9項研究中的I期患者，OS風險比HR=4.2（95%CI: 2.65-6.65, P＜0.02）。

然而，ACOSOG Z0040[18]的研究結果卻未能證實以上結論，術前和術后PLC陽性率分別為3.3%（29/885）和2.0%（17/871），PLC性質與患者OS無相關性。

如何解釋這一爭議？研究結果的矛盾性一方面與納入meta分析的各個研究并沒有采用標準的灌洗方法且大多數研究的隨訪時間都少于3年有關；另一方面可能與ACOSOG Z0040 PLC陽性檢出率過低，使得陽性組和陰性組的可比性差有關。

表2 探討骨髓微轉移預后作用的主要臨床研究Tab 2 Major clinical studies of the prognostic value of DTC in bone marrow

3.4 外周血微轉移與NSCLC預后 腫瘤細胞脫落、侵襲并進入血液循環是實現腫瘤轉移的最初階段。楊浩賢等[34]用逆轉錄PCR檢測肺癌患者和肺良性疾病患者外周血中的LUNX mRNA，肺良性病變患者外周血中未見LUNX-mRNA表達，4例術前和術中LUNX mRNA表達陽性的患者，術后1周轉為陰性，提示外周血中LUNX mRNA來源于肺的原發腫瘤細胞。周清華等[35]用逆轉錄PCR，檢測患者外周血中CK19 mRNA表達，提示外周血“微轉移”是預測局部晚期NSCLC預后的獨立因素。

近年來，許多研究通過計算外周血中CTCs數目來檢測外周血微轉移。在肺癌患者中，CTCs數量與腫瘤進展呈正相關，尤其伴隨腫瘤遠處轉移灶的增多而升高。檢測腫瘤患者外周血CTCs可早期評估腫瘤轉移風險，預測腫瘤復發和判斷患者預后。

Hofman等[36]檢測了208例可手術NSCLC患者和39例健康對照者的外周血。他們采用ISET法檢測外周血中非血細胞的循環細胞（circulating nonhematologic cells,CNHCs)。受試者平均隨訪24個月。上述患者中，CNHCs平均個數是40。CNHCs≥50和＜50的患者相比，OS和DFS均更短，差異有統計學意義（P=0.002和P=0.001）。單因素和多因素分析均顯示，排除疾病分期的影響，術前CNHCs數目≥50預示著更短的DFS和OS。Krebs等[37]通過CellSearch系統檢測101例局部晚期和晚期NSCLC患者外周血CTCs。IV期患者外周血中CTCs數目（0-146）明顯高于IIIb期（0-3）和IIIa期（未檢測到）。單因素分析顯示，化療前每7.5 mL外周血中CTCs＜5個和≥5個的患者的PFS分別是6.8個月和2.4個月（P＜0.001），OS分別是8.1個月和4.3個月（P＜0.001），差異有統計學意義。多因素分析顯示，CTCs數量是OS的最強預測因子。

4 微轉移檢測的臨床意義及研究展望

對NSCLC患者的微轉移灶進行檢測，一方面支持NSCLC早期的全身隱匿性播散，提示NSCLC是一種全身性疾病而非局灶性病變；另一方面，可以補充常規病理學確認的TNM分期，為更準確的“分子分期”提供依據，從而指導治療方案的選擇。目前NSCLC微轉移的研究中，還存在幾個問題：①尚缺乏特異性強、靈敏度高的理想檢測標志物；②對特定的檢測部位最優的檢測方法不統一，假陽性和假陰性等問題影響了研究結論；③骨髓腔中DTCs和外周血CTCs的最佳檢測時間尚不明確；④檢測出有微轉移的患者應采取何種治療措施沒有循證醫學證據。同時，微轉移對NSCLC的預后價值還存在爭議，微轉移的檢出并不代表一定會形成顯性轉移灶，腫瘤細胞自身生物學特性、機體免疫狀況和局部微循環等都是重要的影響因素。因此，篩選敏感性和特異性均較高的分子標志物是今后研究的一個方向。同時為得到更為可靠的研究結論, 減少假陽性結果，獲取恰當的組織標本、選擇合適的檢測方法、建立詳盡的檢測過程及制定規范的質控標準極為重要。未來我們期待多中心合作，開展前瞻性的臨床研究，采用統一規范的標準對肺癌微轉移灶進行檢測，明確微轉移對NSCLC的預后價值。同時，對伴有微轉移的NSCLC患者予以恰當的輔助治療，試圖消除微小殘留病灶，獲得生存獲益。