小劑量多西他賽持續化療聯合樹突狀細胞生物免疫治療抑制VEGF分泌

周嚴 王慧敏 鐘華

肺癌是我國最多發的一種惡性腫瘤，極易發生侵襲和遠處轉移，約75%的患者就診時已處于晚期階段（III期或IV期），5年生存率僅為30%左右[1,2]，死亡率居惡性腫瘤死亡率首位。肺癌的遠處轉移是造成其生存率低下的主要原因之一。因此，深入探討肺癌的侵襲和轉移機制，尋求有效抑制侵襲轉移的方法，是當前焏待解決的問題。迄今針對腫瘤瘤體本身的傳統多學科綜合治療，如手術、放療、化療等，被證實無法突破決定肺癌患者生存的頸瓶—癌細胞轉移，我們需要重新審視傳統治療策略，尋找新的治療突破點。

小劑量持續化療聯合樹突狀細胞（dendritic cell, DC）的生物免疫治療是一種全新的治療模式，除了收獲小劑量持續化療本身抑制腫瘤新生血管的益處外[3,4]，還有望改變肺癌局部的微環境，而此種微環境中產生的細胞因子網絡有利于樹突狀細胞發揮免疫監管的作用，兩種方法在肺癌的治療模式中將會產生互補和疊加的效應。

本試驗將利用負荷3LL肺癌細胞的C57/BL6J小鼠，應用多西他賽的小劑量持續化療聯合樹突狀細胞的生物免疫治療方法，觀察聯合治療的抑瘤效應和腫瘤微環境中與腫瘤新生血管生成相關的細胞因子分泌的變化。

1 材料與方法

1.1 材料 6周-8周齡的C57/BL6J小鼠為研究對象，雄性，質量20 g左右，SPF級。動物生產許可證SCXK（滬）2007-0001；動物使用許可證 SCXK（滬）2008-0043。多西他賽，相對分子質量為862，賽諾菲安萬特公司產品；Lewis肺癌細胞（3LL）（中國科學院上海細胞生物研究所）；鼠源性IL-4和GM-CSF（PeprTech）；液態芯片（Luminex）及試劑盒（BD）；微滲析儀及相關導管，探針及連接器。

1.2 方法

1.2.1 鼠源性DC的培養 第1天，培養鼠源性骨髓來源的DC：分離小鼠的股關節，取出兩條完整的自股關節到踝關節的肢體，針頭插入小鼠骨髓腔中，培養液沖洗。在細胞沉淀中依此加入紅細胞裂解液和抗體CD4、CD8、CD220以及補體，去除紅細胞及T、B淋巴細胞。將DC前體細胞放置于37oC培養箱中2 h，收集懸浮細胞，在懸浮細胞中按照GM-CSF 1 U/mL、IL-4 0.5 U/mL加入細胞因子。第6天，收獲培養的DC。

1.2.2 不同治療方式的建立 24只小鼠分別在皮下注射0.5×106個3LL腫瘤細胞；10 d后成瘤。測量小鼠體積，體積計算按照: 1/2長徑×短徑2平衡各組小鼠體積后，隨機分4組：對照組（3LL）、DC免疫治療組（3LL+DC）、小劑量持續化療組（3LL+chemo）和DC免疫治療聯合小劑量化療組（3LL+DC+chemo）。四組治療的具體內容如下：①3LL組：瘤內注射PBS液10 μL；②3LL+DC組：腫瘤種植后11 d、15 d瘤內注射2×106/50 μL DC皮下注入瘤內DC；③3LL+chemo組：每周3次，每次0.2 mg/kg劑量瘤內注射多西他賽；④3LL+DC+chemo組：瘤內11 d、15 d注射2×106/50 μL DC皮下注入瘤內DC，除此之外，每周3次，每次按照0.2 mg/kg劑量瘤內注射多西他賽。繪制小鼠的生存曲線。

1.2.3 微滲析儀技術結合Luminex 技術 第22天時，各組小鼠中隨機取出一只放置于玻璃籠中，局麻下腫瘤內置入探針，利用微泵將交換液泵入瘤體內，活體狀態收集組織間液。小鼠保持清醒，在玻璃籠中正常進食和活動。應用微滲析儀（Microdialysis）聯合液態芯片（Luminex）方法分析各組與腫瘤新生血管相關的細胞因子：人堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）。該實驗重復3次。

1.3 統計學處理 采用SPSS 11.0 軟件進行統計學分析，Oneway ANOVA法進行組間比較，生存曲線采用Sigma Plot 11.0軟件，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組荷瘤小鼠的生存曲線 采用不同治療模式的小鼠生存時間如圖1所示，3LL+DC+chemo能延長荷瘤小鼠的生存時間為（27.6±3.2）天，與3LL組（13.5±2.7）天、3LL+DC組（13.1±2.3）天、3LL+chemo組（11.8±3.0）天相比，差異具有統計學意義（P=0.008, P=0.01, P=0.01）。

2.2 各組治療組腫瘤內部細胞因子分泌差異 采用微滲析儀聯合Luminex方法檢測各組荷瘤小鼠在不同時間分泌的細胞因子：bFGF（表1）和VEGF（圖2）的表達。結果顯示：bFGF的分泌在不同治療組的不同時段分泌的差異沒有統計學意義。而VEGF 的分泌在聯合治療組分別在48 h及72 h時有下降趨勢，差異具有統計學意義。

3 討論

2004年Kerbel等[3]在Nature Rev Cancer雜志上報道，小劑量持續化療較之于傳統化療的優勢是，在殺傷癌細胞的同時，還能抑制癌周微環境中新生血管內皮細胞的生長。這種小劑量持續化療以投予頻繁的化療藥物與短暫休息間隔交替進行為特點。其應用于臨床最大的益處將是患者對此接受度高并且有很好的耐受性。多西他賽是一種新穎的細胞毒藥物，其作用機制是加強微管蛋白聚合作用和抑制微管解聚作用，導致穩定的非功能性微管束形成，因而能破壞腫瘤細胞的有絲分裂。目前，多西他賽已經成為肺癌患者化療的首選藥物。然而，在常規劑量下，經常會出現強烈的副反應，包括胃腸道、血液系統的毒副反應，嚴重者甚至危及患者生命。因此，應用小劑量持續療法，既能抑制腫瘤新生血管，又能起到減輕化療毒副反應的作用是一種新穎的化療方法。

圖2 不同治療模式下腫瘤微環境中血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）的分泌。3LL瘤體內VEGF的分泌隨著腫瘤的生長呈升高趨勢。各治療組內的VEGF分泌較3LL組都有下降的趨勢。在3LL+DC+chemo組，這種抑制作用在48 h、72 h時最為明顯，與各組之間的差異具有統計學意義（P＜0.05）。Fig 2 VEGF secretion in tumor microenvironment in different treatments. With the growth of tumor, the secretion of VEGF in 3LL tumor increased. Compared with 3LL group, VEGF secretion was reduced in the other three groups. This inhibition presented obviously in 48 h and 72 h in metronomic chemotherapy combination with DC vaccine group, compared with other groups, P＜0.05.

表1 不同治療模式下腫瘤微環境中bFGF的分泌Tab 1 bFGF secretion in tumor microenvironment in different treatments

DC是唯一能向初始T細胞遞呈抗原，并激發T細胞及B細胞免疫應答的、功能最強的專職性抗原遞呈細胞，在調節機體免疫反應，尤其在啟動抗腫瘤免疫反應中起關鍵作用。DC激發免疫反應有如下特點：①極少量的DC就能激發強大的T細胞免疫應答；②可以激活靜止狀態的T細胞群；③在體內可以同時致敏CD4+T輔助細胞和CD8+T殺傷細胞[5,6]。但目前單純應用DC免疫治療肺癌尚未獲得預期的療效，究其原因，可能是以DC為基礎的免疫生物療法的有效性更多地體現在改變腫瘤局部的微環境，防治腫瘤轉移，從而提高荷瘤宿主的帶瘤生存期，而不是直接的殺瘤效應[7,8]。因此，我們設想，如能以多西他賽小劑量持續化療法聯合DC免疫生物療法，可望獲得更強大的抗肺癌效果。在此試驗中，我們應用荷瘤動物驗證我們的想法。

VEGF是在促進腫瘤血管生成中起主要作用的細胞因子，促腫瘤血管生成的其他因子如人堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）、血小板源性生長因子（platelet derived growth factor, PDGF）、腫瘤壞死因子α（tumor nectosis factor-α, TNF-α）、表皮生長因子（epidermal growth factor, EGF）等，這些生長因子其作用主要通過誘導VEGF表達實現促進腫瘤生長、浸潤和轉移的作用。VEGF及其受體信號通路激活可促進內皮細胞存活、增殖與遷移，也可促進內皮祖細胞被招募至血管生成活躍部位。腫瘤血管生成是一個非常復雜的過程，VEGF、bFGF對血管生成的多個環節，如血管內皮細胞的增殖、分化、遷移和管腔狀結構的形成、血管內皮基底膜的降解等均有明顯的促進作用。VEGF及其受體的表達還受到bFGF的調控，bFGF在體內外均能誘導VEGF的合成，還能上調VEGF受體Flk-l的表達。

我們的試驗結果顯示：小劑量持續化療聯合樹突狀細胞生物免疫治療能夠延長荷瘤小鼠的生存，一定程度上在于聯合治療抑制瘤內VEGF的分泌，可能通過瘤體內VEGF的抑制產生了抑制腫瘤新生血管的形成。除此之外，小劑量持續化療聯合樹突狀細胞生物免疫治療比之于單一的治療方式獲得生存獲益的原因在于化療本身刺激了腫瘤抗原的廣泛釋放，刺激了免疫細胞發揮強大的抗原提呈作用。更多的內在機制需要大樣本的實驗研究證實。