肺腺癌骨轉移裸小鼠模型的建立及MicroCT觀察

崔永奇 耿沁 顧愛琴 朱淼鑫 孔韓衛 孫磊 劉蕾 閆明霞 姚明

肺癌是全球范圍內發病率和致死率最高的惡性疾病之一，大約90%的肺癌患者死于轉移[1,2]，而骨轉移占晚期肺癌的50%-70%[3]，這將進一步引起高血鈣癥、神經壓迫、殘疾、病理性骨折等癥狀，導致患者生活質量的迅速下降[4]。但是，目前在治療肺癌骨轉移方面我們取得的成果還很少，尚且沒有一種完全有效的方法來預防和治療骨轉移。由于肺癌骨轉移灶的形成是一個多因素、多步驟的復雜的生物學過程[5]，因此，一個合適的可以用來了解和探討肺癌骨轉移機制的小動物模型的建立就顯得尤為重要，這對于以后探索出新的肺癌骨轉移臨床預防和治療方案具有深遠的意義。

由于在肺癌的幾種病理類型中腺癌的骨轉移率最高[6]，因此本實驗我們以幾種肺腺癌細胞系為基礎進行肺癌骨轉移裸小鼠模型的建立，希望能為以后進行肺癌骨轉移機制的研究提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 本實驗使用了四種肺腺癌細胞系：A549、NCI-H1299（以下簡稱H1299）、SPC-A-1、XL-2。其中A549、H1299由ATCC提供，SPC-A-1由上海市胸科醫院提供，XL-2[7]是我們實驗室從發生全身轉移的肺腺癌病人的腹水中分離并建系。

1.1.2 實驗動物 SPF級BLAB/c-nu/nu裸小鼠50只，雌雄兼用，6 w-8 w鼠齡，體重20 g-22 g，由上海市腫瘤研究所提供，實驗動物生產許可證號為SCXK (滬) 2012-0001；所有小鼠均在無特殊病原體 (specific pathogen free, SPF) 級環境中飼養，飼料和水自由攝入，使用許可證號為SYXK(滬) 2012-0001。

1.1.3 主要試劑、耗材 胎牛血清FBS（Biowest, South America Origin），4%多聚甲醛固定液和EDTA脫鈣液(上海威奧生物科技有限公司）、Transwell小室（8 μm pore size, Corning, USA）、Matrigel Matrix（BD Bioscience,USA）

1.1.4 儀器設備 微計算機斷層掃描技術（micro computed tomography, MicroCT）（skyscan1076，比利時）、全自動病理分析系統（Leica，德國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 A549、H1299、SPC-A-1、XL-2四種細胞系培養條件為DMEM培養基，內含10%胎牛血清和青霉素（100 U/mL）及鏈霉素（100 mg/mL），細胞培養條件為37oC、5%CO2。

1.2.2 細胞增殖能力 四種細胞均取2,000個加入到96孔板各孔內，每天各種細胞均取3個孔，每孔加CCK8（Dojindo, Japan）、DMEM混合液110 μL，2 h后檢測450 nm波長處吸光度以計算每孔內活細胞的數目。實驗獨立重復3次。

1.2.3 細胞體外侵襲、遷移能力 將凍存于-20 °C Matrigel膠放于4 °C過夜，使其由凝固狀態變為液態；用DMEM將其稀釋到1 mg/mL，并迅速加入到Transwell上室內膜上、鋪平，每個小室40 μL，37 °C孵育2 h。用DMEM懸浮細胞，濃度調整至1×105/0.2 mL，接種于各上室，在各下室加入800 μL含10%FBS的DMEM培養基，37 °C培養箱中孵育，18 h后取出小室，棄去培養基，用棉簽拭去內表面未侵襲細胞；將各個Transwell放入100%甲醇中室溫固定30 min，棄去各個上室內甲醇后，再將其放入0.1%結晶紫中染色30 min，然后PBS洗2遍，棉簽將小室內表面擦拭干凈，倒置顯微鏡下拍照，計數遷移到小室外表面的細胞數目，取平均值，實驗重復3次。細胞遷移實驗與侵襲實驗不同之處：上室不需加入DMEM稀釋的Matrigel膠，細胞濃度為5×104個/0.2 mL，孵育時間為12 h左右。

1.2.4 模型建立

1.2.4.1 實驗分組 將50只裸小鼠隨機分為5組，每組10只，其中一組為對照組，每只左心室注射0.2 mL生理鹽水，另外四組為實驗組，每只左心室注射0.2 mL相應四種肺腺癌細胞懸液，分別命名為A549實驗組、H1299實驗組、SPC-A-1實驗組、XL-2實驗組。

1.2.4.2 左心室注射 將以上四種細胞于細胞對數生長期消化下來，加入不含血清的DMEM培養基，調整細胞濃度為1×106/0.2 mL，將小鼠仰臥固定在固定板上，用1%戊巴比妥鈉按照每克小鼠體重0.01 mL的劑量進行腹腔注射麻醉，酒精棉球常規消毒小鼠前胸壁，1 mL胰島素注射器（29 G, BD Bioscience）抽吸0.2 mL細胞懸液于胸骨左旁3 mm第二肋間、與胸廓成45度夾角，對準正中進針，一般進針6 mm，當針尖頭有自動持續的鮮紅色動脈血不斷搏動地進入針芯即表明真尖已進入左心室。對照組小鼠用同樣的方法進行注射，每只僅注射0.2 mL生理鹽水。術后繼續在SPF環境中飼養，并密切觀察小鼠狀態。

1.2.5 MicroCT掃描 觀察小鼠狀態，自左心室注射術后第2周起定期對各組小鼠運用MicroCT進行掃描（條件為40 KV，250 mA，分辨率35 μm），以確定是否已發生肺癌骨轉移以及骨轉移部位，并進行拍照，三維重建。

1.2.6 組織病理學鑒定 以小鼠出現明顯消瘦為這組實驗結束點。選取實驗組及對照組小鼠中軸骨（如：肋骨、脊柱、髂骨、肩胛骨）、四肢長骨等部位骨組織，將其截成0.5 cm×0.3 cm×0.2 cm大小骨片，生理鹽水清洗后立即投入冷凍的4%多聚甲醛固定液中，4 °C固定12 h-24 h；固定結束后骨片在0.2 mol磷酸緩沖液中充分漂洗。漂洗結束后投入EDTA脫鈣液中，室溫下脫鈣，脫鈣液每4天-5天更換一次新液，經過3次更換新液后，此后每天更換新液，直至骨片完全脫鈣為止，每日檢查脫鈣情況，以大頭針能刺進骨密質為完成脫鈣標準。脫鈣結束后，骨片用蒸餾水沖洗20 min，然后進行常規脫水處理、石蠟包埋、切片（切片厚度4.5 μm），行蘇木素-伊紅染色。

1.2.7 統計學分析 數據采用SPSS 19.0統計軟件進行統計分析。計量資料用Mean±SD表示，組間比較采用卡方檢驗或單因素方差分析，P＜0.05為具有統計學差異。

2 結果

2.1 四種細胞體外增殖能力分析 如圖1所示。

2.2 四種細胞之間體外侵襲、遷移能力比較 Transwell結果顯示四種細胞體外無論是侵襲能力還是遷移能力均按A549、H1299、SPC-A-1、XL-2的順序由高到低排列，具體結果如圖2所示。

2.3 模型建立

2.3.1 模型建立情況 5組小鼠左心室注射后全部成活。至實驗結束，對照組小鼠生長狀況良好，無明顯消瘦、活動障礙等情況；實驗組小鼠每組術后均有一定概率的消瘦，脊柱彎曲、肋骨、肩胛骨、下頜骨、髂骨、四肢長骨等不同部位的骨轉移現象發生，每組小鼠骨轉移率及具體骨轉移部位見表1、表2。

2.3.2 MicroCT結果 對照組小鼠MicroCT顯示骨密度均勻，未見骨質缺損、骨折現象發生；實驗組小鼠每組內均可見脊柱、肩胛骨、下頜骨、四肢長骨等不同部位低密度病灶，骨皮質缺損、骨組織破壞嚴重（圖3）。

2.3.3 組織病理學結果 對照組小鼠骨組織切片正常，未發現轉移灶；每個實驗組小鼠骨組織切片經HE染色發現有肩胛骨、股脛骨、肋骨、脊柱等不同部位的腫瘤轉移灶：骨髓腔內成片的腫瘤細胞排列紊亂、細胞分化差、核大濃染，骨組織結構消失，如圖4所示。

2.4 骨轉移分析

2.4.1 四個實驗組骨轉移結果 體內實驗每個實驗組出現轉移的小鼠數目、出現轉移癥狀所用時間如表1所示。

圖1 體外生長曲線檢測四種細胞之間群體細胞增殖能力。*P＜0.05，差異具有統計學意義。Fig 1 In vitro cell growth curve assay of four cell lines. *P＜0.05,there was statistical significance among the proliferation ability of the four cell lines.

圖2 體外侵襲、遷移實驗檢測四種肺腺癌細胞系之間侵襲、遷移能力的差異。A：四種肺腺癌細胞之間遷移實驗（×100）；B：四種肺腺癌細胞之間侵襲實驗（×100）；*P＜0.05，四種細胞之間侵襲、遷移能力差異均有統計學意義。Fig 2 In vitro invasion and migration assays of 4 lung adenocarcinoma lines. A: The migration ability of 4 lung adenocarcinoma lines using the migration assay (×100); B: The invasion ability of the 4 lung adenocarcinoma lines using the matrigel invasion assay (×100); *P＜0.05, there was statistical significance.

圖3 對照組及各實驗組小鼠MicroCT。A1-D1：對照組小鼠正常脊柱、肋骨、脛骨、肩胛骨MicroCT結果；A2：A549實驗組內出現的脊柱轉移；B2：H1299實驗組內出現的肋骨轉移；C2：SPC-A-1實驗組內出現的脛骨破壞；D2：XL-2實驗組內出現的肩胛骨變化；箭頭所示處為各部位的骨質破壞。Fig 3 MicroCT of the mice in the assay. A1-D1: MicroCT of the mice in the control group show the normal spinal column, rib, tibia and scapula;A2: MicroCT of the mice in the A549 experimental group shows the spinal column metastasis; B2: MicroCT of the mice in the H1299 experimental group shows rib metastasis; C2: MicroCT of the mice in the SPC-A-1 experimental group indicates tibia metastasis; D2: MicroCT of the mice in the XL-2 experimental group indicates scapula metastasis; Arrows show different bone metastatic sites of lung cancer.

圖4 實驗組及對照組小鼠骨切片HE染色。A1：對照組小鼠正常脊柱；A2：A549實驗組小鼠脊柱發生腫瘤轉移的情況；B1：對照組小鼠正常肋骨；B2：H1299實驗組小鼠肋骨處腫瘤轉移情況；C1：對照組小鼠正常脛骨；C2：SPC-A-1實驗組腫瘤脛骨轉移；D1：對照組小鼠正常肩胛骨；D2：XL-2實驗組小鼠發生腫瘤肩胛骨轉移。Fig 4 HE staining was performed to confirm the bone lesion in the control group and experimental groups. A1: The normal spinal column in the control group; A2: Spinal column with tumor metastasis in the A549 experimental group; B1: Normal rib in the control group; B2: Rib with tumor metastasis in the H1299 experimental group; C1: Normal tibia in the control group; C2: Tibia with tumor metastasis in the SPC-A-1 experimental group; D1: Normal scapula in the control group; D2: Scapula with tumor metastasis in the XL-2 experimental group; T: Tumor, B: Bone.

表1 四個實驗組每組小鼠出現骨轉移所用平均時間及每組骨轉移概率Tab 1 The average time cost and the bone metastatic rate of each experimental group

表2 各實驗組骨轉移部位分析Tab 2 Analysis on the bone metastatic sites of the experimental groups

2.4.2 轉移部位分析 至實驗結束A549實驗組、H1299實驗組、SPC-A-1實驗組、XL-2實驗組出現骨轉移的小鼠總數依次為 6只、4只、5只、4只，對每個實驗組內出現的骨轉移按照中軸骨、四肢長骨進行歸類，具體結果如表2。

3 討論

目前對于骨轉移模型建立的研究比較多的集中于乳腺癌[8,9]及前列腺癌[10]，而對于肺癌骨轉移模型建立的報道還比較有限，腺癌作為肺癌中骨轉移率最高的一種病理類型，對其骨轉移機制的探索越來越引起人們的重視。針對這一特點，本實驗經過大量預實驗的探索，最終通過左心室注射的方法獲得了經影像學、組織病理均證實發生了骨轉移的肺腺癌裸小鼠模型。臨床上肺癌骨轉移的部位通常首先累及中軸骨，其次為股骨、肱骨等四肢長骨，本實驗中四個實驗組內每組出現中軸骨轉移的概率均明顯高于四肢長骨，這與Coleman等[11,12]研究的結論一致，肺腺癌骨轉移裸小鼠模型建立成功。

左心室注射法是目前使用較廣泛的一種腫瘤轉移動物模型制作方法[13]，有很多優點，并且能驗證“種子與土壤”學說[14]：腫瘤細胞充當種子，骨髓微環境充當土壤。在腫瘤細胞從原發灶脫落開始直至新的轉移灶形成的過程中，這種方法建立的骨轉移模型模擬的是腫瘤細胞從進入血液循環開始，隨著血流到達骨的毛細血管床、穿過血管內皮間隙進入骨組織、與骨組織微環境經過一系列相互作用、在骨內增殖和導致骨質重構的過程；這與脛骨內注射法建立的乳腺癌及前列腺癌等惡性腫瘤的骨轉移模型相比更接近于腫瘤轉移的真實過程，因為后者模擬的只是腫瘤細胞定位于骨組織后的過程；所以，使用左心室注射的方法建立的肺癌骨轉移模型形成的骨轉移灶更與臨床相似；并且，脛骨內接種的方法表現的骨轉移主要為長骨骨干轉移，這與臨床上常見的椎體及骨骺端轉移有所不同。

但左心室注射法由于易導致腦、肺、腎上腺皮質等其他部位和器官多發性轉移的缺點[15-16]，以致骨轉移灶尚未形成，實驗動物已死于其他部位轉移；再加上樣本量有限等，可能導致了本實驗中盡管我們選用的四種肺腺癌細胞系體外侵襲、遷移能力均按A549、H1299、SPC-A-1、XL-2的順序由高到低排列，但體內四個實驗組骨轉移率的高低以及出現骨轉移所用平均時間的長短卻未呈這樣的順序排列。至于導致這種現象的具體原因，還有待于以后更進一步的實驗探索。

與傳統的放射學技術相比，MicroCT分辨率高、不存在圖像重疊、偽影、比例放大等不足；與傳統的組織學切片技術相比，MicroCT能夠在不破壞樣品的情況下對骨組織、活體小動物進行成像，還能精確進行圖像三維重建，它成為我們判斷骨組織破壞情況較為精準的方法之一。

總之，我們成功地建立了肺腺癌骨轉移裸小鼠模型，成為研究肺腺癌乃至肺癌骨轉移分子機制、探索出新的臨床預防和治療方案不可缺少的工具。