溫針灸對嗎啡戒斷大鼠腦區CREBmRNA表達的影響*

衛 哲，董 哲，王 威

(1.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江哈爾濱 150001;2.哈爾濱市兒童醫院，黑龍江哈爾濱 150010)

嗎啡濫用給全世界帶來了巨大損害，對嗎啡成癮后的戒毒治療已成為醫學界研究的熱點。針灸治療具有安全、可靠、副作用少等優點，已被廣大患者認可，并很快得到推廣應用［1］。溫針灸能激發經氣，促進周身氣血流動，抗御外邪，使臟腑失調的功能趨于平衡。目前，關于溫針灸改善大鼠戒斷癥狀方面的研究尚不多見。本實驗通過觀察溫針灸對減輕大鼠戒斷癥狀的作用以及腦內環腺苷酸反應元件結合蛋白(cAMP Yesponse element binding protein，CREB)mRNA 的表達，探討其對戒斷后中樞的影響機制。

1 材料

1.1 動物

SD大鼠(黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供)，40只，雄性，體重(190±30)g。動物在實驗前進行適應性馴養1周。

1.2 主要試劑和藥品

鹽酸嗎啡注射液(沈陽第一制藥廠，批號20080802);鹽酸納絡酮注射液(成都倍特藥業有限公司，批號20081103);逆轉錄酶AMV(Pormgea公司);Taq酶(上海生工)。

1.3 主要儀器與設備

AB－160型電子分析天平(山西太原航空航天工業部太行儀表廠)、ABI7500熒光定量PCR擴增儀(美國PerkinElme公司)等。

2 實驗方法

2.1 動物分組

將40只大鼠隨機分為對照組、模型組、溫針灸組、手針組，每組10只。

2.2 造模方法

根據相關文獻資料［2］進行造模，采用逐日遞增法，在背部皮下注射鹽酸嗎啡注射液，劑量分別為20 mg/kg、30 mg/kg、40 mg/kg、50 mg/kg、50 mg/kg，每天2次(8 am、4 pm)，連續5天。于最后注射后3 h進行納絡酮戒斷，用量為3 mg/kg，隨后觀察10 min內大鼠的戒斷反應，將符合評分者作為模型動物。評分結果見表1。

表1 各組嗎啡依賴大鼠戒斷癥狀評分比較(±s)

表1 各組嗎啡依賴大鼠戒斷癥狀評分比較(±s)

注:與對照組相比，△P ＜0.05。

0.3 ±0.48模型組 20.5 ±4.16△溫針灸組 19.4 ±4.92△手針組 20.6 ±6.81組別 戒斷總分對照組△

表1示，對照組以外的各組大鼠出現不同程度的戒斷癥狀，并且與對照組比較有統計學意義(P＜0.05)，表明成功建立嗎啡戒斷大鼠模型。

2.3 各組處理

對照組與嗎啡注射者以相同時間、方法注射生理鹽水，第6天開始每日四肢捆綁固定。模型組按上述方法造模，第6天開始每日四肢捆綁固定。溫針灸組于第6天開始進行溫針灸治療，取百會、雙側腎俞、三陰交、足三里，針刺得氣后，在針尾上搓捏少許艾絨點燃施灸，只待燃盡，除去灰燼，留針稍許再將針拔出，共計留針15 min，治療6天。手針組于第6天開始予針刺治療，取穴方法同溫針灸組，得氣后留針15 min。

2.4 取材

治療結束后的第二天將大鼠以戊巴比妥麻醉后開胸，固定液進行灌注固定，開顱，完整取出全腦組織，分離伏隔核(NAc)，液氮保存。

2.5 檢測大鼠腦區CREB基因的表達

以Real－time PCR法進行檢測。取300 mg組織樣放置于－80℃保存的研缽中，倒入液氮，快速研磨，裝入5 ml離心管中。加入4.5 ml Trizol提取液。室溫溫育5 min，12 000 rpm 離心10 min，取上清，加1 ml氯仿并離心15 min。移上清后加3 ml異丙醇混勻并放置，再次離心 10 min。棄上清，加 75%乙醇并7 500 rpm離心5 min。棄乙醇，干燥，加 DEPC－treat溶解總RNA，進行反轉錄［3－4］。具體操作過程按照試劑盒說明書進行。

2.6結果分析

選擇β－action為內參，以SDS7000軟件獲得各樣本的Ct值，通過2－△△Ct計算CREB相對mRNA表達水平。表達差別倍數以2－△△Ct表示。

2.7 統計學處理

由SPSS13.0統計軟件包進行數據處理，采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

大鼠NAc腦區CREBmRNA表達的變化，見表2。

表2 大鼠NAc腦區CREBmRNA的表達(±s，n=10，ng/L)

表2 大鼠NAc腦區CREBmRNA的表達(±s，n=10，ng/L)

注:與模型組比較，△P ＜0.05;與手針組比較，▲P ＜0.05。

組別 CT(CREB) CT(action) 2－ΔΔCT對照組 25.18 ±0.14 17.57 ±0.2 0.078(－0.156 －0.304)模型組 24.79 ±0.1820.91 ±0.22 1.0(0.91 －1.09)溫針灸組 24.5 ±0.15 18.32 ±0.09 0.199(0.008 －0.388)△▲手針組 23.99 ±0.1419.24 ±0.31 0.648(0.477 －0.817)△

由表2所示，與模型組比較，溫針灸組、手針組的腦區CREBmRNA表達明顯降低，差異有顯著性意義(P＜0.05)。與手針組比較，溫針灸組腦區CREBmRNA表達降低，差異有顯著性(P＜0.05)，說明針灸治療可以調整大鼠戒斷后CREBmRNA的表達，以溫針灸對CREBmRNA表達改善為著。

4 討論

本實驗通過不同的針灸方法對嗎啡成癮后大鼠的戒斷癥狀進行治療，結果顯示，溫針灸能夠減輕大鼠戒斷癥狀，并且明顯降低大鼠腦區的CREBmRNA表達(P＜0.05)，認為其參與了嗎啡成癮后戒斷的中樞調節機制。

反復給藥不但會出現一系列的成癮表現，還會出現腦功能的長時程變化，并且出現基因表達調節改變［5］。一般認為，基因表達的關鍵是基因轉錄的調控，CREB轉錄因子家族調控多種基因的表達，在AC－cAMP系統的上調中似乎起關鍵作用，這可能是自身內穩態調節機制發揮作用的結果。研究發現，NAc不僅參與調控急性強化效應，同時介導嗎啡依賴形成過程中長時程適應的改變［6］。

研究發現［7］，CREB在不同的神經元內調節不同目標基因，也可能是調節不同神經元產生相同的效應，但是最后的行為學效應不同。CREB能夠參與調節行為記憶，并且起到關鍵作用。但相對來講，CREB活性是短暫的，例如，慢性給藥后CREB活性在藥物撤退后幾天內就恢復正常水平，這意味著這種長時轉變可能啟動與成癮和記憶有關的更加穩定的行為改變，比如通過其他基因的調節，提示還應有其他因子參與［7－8］。

本實驗初步分析溫針灸對大鼠戒斷癥狀的影響，其作用除了調節腦區CREB基因表達之外，還存在對其它多種基因的影響，針灸戒毒有很大的應用前景，還有待于進一步探討其中樞作用機制。

［1］舒榮，文秀英，茹立強.國內外針灸戒毒研究進展［J］.中國針灸，2003，23(2):121 －125

［2］紀家濤，王新華，由振東，等.嗎啡依賴大鼠模型的建立［J］.第二軍醫大學學報，1997，18(1):81 －82

［3］曾俊杰，孫凱，吳承堂，等.應用實時熒光定量PCR檢測結直腸癌與癌旁組織中 miRNA－221的差異表達狀況［J］.山東醫藥，2010，50(12):26 －28

［4］鄒湘輝，莊東紅，吳云影，等.實時熒光定量PCR檢測小鼠腦組織中3－羥基丁酸受體基因PUMA－G的轉錄表達［J］.廣東醫學，2010，31(1):58 －60

［5］衛哲.電針對嗎啡戒斷后大鼠中樞谷氨酸－多巴胺動機環路作用機制的研究［D］.哈爾濱:黑龍江中醫藥大學，2011

［6］Hawes JJ，Narasimhaiah R，Picciotto MR.Calanin attenuates cyclic AMP regulatry element－binding protein(CREB)phosphorylation induced by chronic morphine and naloxon chanlleng in Cath.a cell and primary striatal cultures［J］.J Neurochem.2006，96:1160 －1168

［7］Berke JD，Hyman SE.Addiction，dopamine and the molecular mechanisms of memory［J］.Neuron，2000，25，515 －532

［8］Blendy JA，Maldonado R.Genetic analysis of drug addiction:The role of cAMP response element binding protein［J］.Journal of Molecular Medicine，1998，76，104 －110