神經調節因子Neuregulin-1及其受體ErbB2、ErbB4在恒河猴大腦、小腦的表達及分布

張慶慧 黃佩芝 梅金平 劉 洋 余 洋 趙煒疆▲

1.汕頭大學醫學院神經科學中心，廣東汕頭 515041;2.天津中醫藥大學研究生院，天津 300193

神經調節因子Neuregulin－1 （Nrg1）最初從乳腺癌腫瘤細胞中提取，是NRG1基因選擇性剪切編碼的類表皮生長因子家族重要成員之一[1]；Nrg1又稱作膠質細胞生長因子（GGF），從牛腦和垂體中提取，體外條件下具有促有絲分裂活性[2]。 Nrg1基因選擇性剪切產生至少6種Nrg1異形體，其中最主要的有Ⅰ到Ⅲ型Nrg1[3]。

ErbB3和ErbB4受體可直接與Nrg1發生作用，作用形式包括同二聚體：ErbB3/ErbB3和ErbB4/ErbB4以及異二聚體形式：ErbB3/ErbB2和ErbB4/ErbB2[4]。Nrg1與其受體相互作用可激活 ERK、AKT、MAPK， PI3γ、PKC 和 Jak-STAT信號，進而引起細胞周期改變、細胞分化、抗凋亡程序啟動和腫瘤形成[5-7]。在發育中的大鼠腦組織中，Nrg1的表達可見于灰質、下丘腦以及小腦。成年期，Nrg1則表達于更廣泛的腦組織區域，包括下丘腦、海馬、基底節以及腦干[7-8]。 Nrg1與其受體ErbB2，ErbB3和ErbB4二聚體復合物相互所用，參與了一系列生物學過程[9-12]。 有報道，Nrg1受體表達于下丘腦星形細胞，在Nrg1旁分泌作用下激活，分泌前列腺素E2，進而刺激黃體生成素釋放激素（LHRH）的釋放，參與性成熟[7-8]。新近研究發現，Nrg1可表達于垂體促性腺激素細胞，并以鄰分泌方式激活泌乳素細胞表面受體磷酸化，促進泌乳素釋放[10-12]。 體外條件下，Nrg1還可促進乳腺癌細胞的侵襲，通過自分泌或旁分泌方式調節肌動蛋白細胞骨架，促進癌細胞轉移[13-14]。

Nrg1已用于恒河猴體內疾病模型研究，如心律失常誘導的心功能衰竭，且重組Nrg1可增加健康獼猴心臟體積[15-17]。Nrg1還可通過提高PKB和Bcl-xl活性來對抗恒河猴心臟衰竭過程中心動過速誘導的心肌細胞凋亡[16]。此外，Nrg1受體ErbB2，ErbB3及 ErbB4 mRNA表達可廣泛見于青年及成年期恒河猴大腦組織[17]。本研究比較觀察Nrg1及其受體ErbB2、ErbB4在成年期恒河猴大腦及小腦灰質、白質中表達與分布，從而促進對Nrg1/ErbB信號通路在大腦、小腦中功能的了解。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠抗Nrg1抗體購自美國Thermo Scientific公司，兔抗ErbB2及兔抗ErbB4抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；抗小鼠DylightTM488及山羊抗兔DylighTMt594購自美國Jackson ImmunoResearch公司。DAPI染液及抗熒光衰減封片劑購自江蘇碧云天生物技術研究所。蘇木精及伊紅染液購自北京中杉金橋生物技術有限公司。含有恒河猴大腦及小腦組織的組織芯片購自陜西超英生物技術有限公司。

1.2 HE染色

4 μm厚恒河猴垂體組織微陣列切片脫蠟、水化，然后入蘇木精液染色約2 min，1%鹽酸酒精分化；之后行伊紅染色，脫水、透明及中性樹膠封片。

1.3 免疫熒光染色

4 μm厚恒河猴組織微陣列切片脫蠟、水化，然后入pH 9.0枸櫞酸鹽緩沖液中80℃抗原修復50 min。室溫冷卻后，切片入PBS中浸泡5 min，10%驢血清室溫封閉60 min，然后加入小鼠抗Nrg1以及兔抗ErbB2抗體或小鼠抗Nrg1及兔抗ErbB4抗體（稀釋比例分別為1∶100）混合液4℃孵育過夜。 PBS洗后，加驢抗小鼠DylightTM488二抗和山羊抗兔DylightTM594二抗（稀釋度均為1∶500）混合液于切片上，室溫孵育1 h。PBS輕洗后行DAPI染色5 min，PBS充分洗滌，并使用抗熒光衰減封片液封片，熒光顯微鏡（德國Zeiss，AXIO IMAGER Z1）下觀察并采集圖像。

2 結果

2.1 Nrg1及其受體ErbB2、ErbB4在恒河猴大腦皮質及白質中表達與分布

H&E染色顯示恒河猴大腦皮質（圖1-A）及白質基本結構 （圖1-B）。免疫熒光雙標法顯示Nrg1可與其受體ErbB2或ErbB4可共位表達于恒河猴大腦皮質部分細胞胞體中，且均呈密集點狀分布（圖2）；而在大腦白質神經纖維集中區域三種分子均有分布，但Nrg1僅與ErbB4存在明顯共定位（圖3）。

2.2 Nrg1及其受體ErbB4在恒河猴小腦皮質及白質中表達與分布

H&E染色顯示恒河猴小腦皮質（圖4-A）及白質基本結構（圖4-B）。免疫熒光顯示Nrg1主要表達于小腦數量較多的顆粒細胞中并廣泛分布于白質神經纖維，熒光雙標顯示Nrg1與其受體ErbB2可共定位于顆粒細胞及白質神經纖維。其受體ErbB4在小腦皮質及白質中無明顯表達和分布，未見與Nrg1存在明顯共定位（圖5）。

3 討論

Nrg1/ErbB受體通路在器官發育、細胞分化以及腫瘤發生中具有重要作用。有報道，Nrg1參與下丘腦神經元膠質細胞間通訊，促進下丘腦LHRH釋放，從而誘導大鼠垂體促性腺激素釋放和正常性成熟[7]。以往研究發現重組Nrg1α可誘導垂體細胞ErbB3受體磷酸化以及ErbB3受體的內源性磷酸化激活[18]，提示Nrg1/ErbB受體通路可能是多種生理和病理條件下重要信號通路的起點，此外還發現Nrg1與其受體ErbB4可部分表達于恒河猴垂體前葉兩鄰近細胞中[11]，說明在高等動物垂體組織中存在以Nrg1及其受體信號通路為基礎的旁分泌和鄰分泌機制。因此，明確高等動物中Nrg1及其受體表達與分布，對進一步研究Nrg1/ErbB受體信號在高等動物中樞神經系統中的作用具有重要意義。

本研究發現在恒河猴皮質Nrg1與ErbB2及ErbB4均存在明顯共定位，提示Nrg1/ErbB受體信號通路在成年高等動物腦組織中具有重要作用，且Nrg1信號通路可能是以旁分泌或自分泌方式，通過ErbB2/ErbB4或ErbB4/ErbB4受體復合物實現的。在大腦白質神經纖維中僅觀察到Nrg1與ErbB4共定位，表明在白質ErbB4/ErbB4是介導Nrg1功能的主要受體復合物形式。與大腦皮質及白質不同，小腦皮質及白質主要表達ErbB2,并與Nrg1共定位。這一結果提示，在恒河猴小腦中ErbB2/ErbB4不是介導Nrg1功能的主要受體復合物形式，ErbB2可能與表皮生長因子受體家族其他成員如表皮生長因子受體（EGFR）共同組成受體復合物介導Nrg1的功能，這一假設有待進一步研究支持。

[1]Ritch PS，Carroll SL，Sontheimer H.Neuregulin-1 enhances survival of human astrocytic glioma cells[J].Glia，2005，51（3）：217-228.

[2]Lemake GE and Brockes JP.Identification and purification of glial growth factor[J].J Neurosci，1984，4（1）：75-83.

[3]Mei L，Xiong WC.Neuregulin 1 in neural development， synaptic plasticity and schizophrenia[J].Nat Rev Neurosci，2008，9（6）：437-452.

[4]Liu J，Kern JA.Neuregulin-1 activates the JAK-STAT pathway and regulates lung epithelial cell proliferation[J].Am J Respir Cell Mol Biol，2002，27（3）：306-313.

[5]Peles E，Ben-Levy R，Tzahar E，et al.Cell-type specific interaction of Neu differentiation factor （NDF/neuregulin）with Neu/HER-2 suggests complex ligand-receptor relationships[J].EMBO J，1993，12（3）：961-971.

[6]Puricelli L，Proietti CJ，Labriola L，et al.Neuregulin inhibits proliferation via ERKs and phosphatidyl-inositol 3-kinase activation but regulates urokinase plasminogen activator independently of these pathways in metastatic mammary tumor cells[J].Int J Cancer，2002，100（6）：642-653.

[7]PrevotV，RioC，ChoGJ，etal.Normalfemalesexualdevelopmentrequires neuregulin-erbB receptor signaling in hypothalamic astrocytes[J].J Neur osci，2003，23（1）：230-239.

[8]Bernstein HG，Lendeckel U，Bertram I，et al.Localization of neuregulin-1alpha （heregulin-alpha） and one of its receptors， ErbB4 tyrosine kinase，in developing and adult human brain[J].Brain Res Bull，2006，69（5）：546-559.

[9]Wilson TR，Lee DY，Berry L，et al.Neuregulin-1-mediated autocrine signaling underlies sensitivity to HER2 kinase inhibitors in a subset of human cancers[J].Cancer Cell，2011，20（2）：158-172.

[10]Zhao W，Ren SG.Neuregulin-1（Nrg1）is mainly expressed in rat pituitary gonadotroph cells and possibly regulates prolactin（PRL） secretion in a juxtacrine manner[J].J Neuroendocrinol，2011，23（12）：1252-1362.

[11]Zhao WJ，Ren SG.Endogenous neuregulin-1 expression in the anterior pituitary of female Wistar-Furth rats during the estrous cycle[J].Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao，2011，31（6）： 921-927.

[12]Zhao W，Shen Y，Ren S.Endogenous expression of neuregulin-1（Nrg1） as a potential modulator of prolactin（PRL）secretion in GH3 cells[J].Cell Tissue Res，2011，344（2）：313-320.

[13]Hijazi MM，Thompson EW，Tang C，et al.Heregulin regulates the actin cytoskeleton and promotes invasive properties in breast cancer cell lines[J].Int J Oncol，2000，17（4）：629-641.

[14]Miller MW，Mooney SM，Middleton FA.Transforming growth factor beta1 and ethanol affect transcription and translation of genes and proteins for cell adhesion molecules in B104 neuroblastoma cells[J].J Neurochem，2006，97（4）：1182-1190.

[15]Zhang R，Li Q，Wang T，et al.Interfering effect of neuregulin upon cerebral ischemic reperfusion injury in rhesus monkeys[J].Zhonghua Yi Xue Za Zhi.（chin），2009，89（19）：1361-134.

[16]Li J，Qiang O，Wang L.Effects of neuregulin on cardiac myocyte apoptosis and PI-3K signal transduction pathway in rapid pacinginduced heart failure in rhesus monkeys[J].Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban，2007，32（3）：408-412.

[17]Tang CS，Ngan ES，Tang WK， et al.Mutations in the NRG1 gene are associated with Hirschsprung disease[J].Hum Genet，2012，131（1）：67-76.

[18]趙煒疆.Heuregulin-1可調節垂體細胞ErbB受體磷酸化[J].神經疾病與精神衛生，2010，10（3）：240-242.