促紅細胞生成素在非小細胞肺癌組織的表達及其與新生血管形成的關(guān)系研究

俞婷婷，張 煥，張 濤，單 莉，韓志剛

惡性腫瘤患者在治療前后均有較高的貧血發(fā)生率，既往研究認為重組人促紅細胞生成素 (rH－EPO)治療腫瘤相關(guān)的貧血可以減少患者輸血、避免輸血感染、改善患者生活質(zhì)量;但近年研究發(fā)現(xiàn)，rH－EPO有可能直接或間接導(dǎo)致腫瘤細胞生長而促進疾病進展，且與促紅細胞生成素 (EPO)的促血管生成作用有關(guān)［1］。EPO可以調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長發(fā)育，引起惡性腫瘤新生血管形成，而新生血管基底膜不完整，腫瘤細胞可通過，與成熟正常毛細血管相比，新生血管更易接受腫瘤細胞，從而成為腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移途徑［2］。本研究通過檢測非小細胞肺癌 (NSCLC)組織中EPO的表達，探討其與新生血管形成的關(guān)系，為臨床更好地應(yīng)用rH－EPO治療NSCLC相關(guān)的貧血提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2010年1—9月收治的經(jīng)病理確診且術(shù)后病理蠟塊保存完好的NSCLC患者58例，術(shù)前均未接受過放療或化療;血紅蛋白、肝腎功能、心電圖檢查正常，無其他惡性腫瘤病史，無心腦血管疾病及其他肺部疾病。58例患者中男37例，女21例;年齡36～75歲，平均54.7歲;鱗癌26例，腺癌32例;pTNM分期 (2009 IASLC國際肺癌分期第7版):Ⅰ期16例，Ⅱ期18例，Ⅲ期24例;高分化8例，中分化31例，低分化19例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例。收集上述患者術(shù)后肺癌組織蠟塊作為觀察組，以距離癌組織邊緣5 cm以外的非腫瘤性肺組織作為癌旁對照組。

選擇新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院同期收治的經(jīng)病理確診且術(shù)后病理蠟塊保存完好的肺良性病變患者45例，其中男30例，女15例;年齡24～68歲，平均53.4歲;肺結(jié)核23例，壞死性上皮肉芽腫性炎10例，肺炎4例，支氣管擴張2例，孤立性纖維腺瘤2例，肺大泡、血管畸形、硬化性血管瘤及支氣管肺隔離癥各1例;有吸煙史22例，無吸煙史23例。收集上述患者術(shù)后良性病變肺組織蠟塊作為良性病變對照組。

1.2 主要試劑 兔抗人EPO多克隆抗體 (H－162)購自美國Santa Cruz公司，兔抗人CD34單克隆抗體、兔抗人內(nèi)皮素多克隆抗體、兔抗人FVⅢ相關(guān)抗原多克隆抗體、鏈霉親和素－生物素復(fù)合物 (SABC)試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺 (DAB)顯色試劑盒購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué) 所有蠟塊組織均經(jīng)甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm切片，連續(xù)4張，選取其中1張復(fù)核病理診斷。60℃恒溫箱烘烤20 min，脫蠟水化;3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，修復(fù)抗原;滴加一抗，4℃冰箱過夜;滴加二抗，沖洗后DAB染色;蘇木精復(fù)染、脫水、封片;以磷酸鹽緩沖液 (PBS緩沖液)代替一抗作為陰性對照，以試劑生產(chǎn)公司提供的切片作為陽性對照。

1.4 結(jié)果判定標準 采用盲法，由2名病理科主治醫(yī)生分別于光鏡下觀察，遇有分歧則通過協(xié)商決定。(1)EPO:主要表達于胞質(zhì)，以胞質(zhì)和 (或)胞膜出現(xiàn)棕色顆粒為陽性表達，同時觀察5個低倍視野 (×200)，分別計數(shù)100個細胞，以其中陽性細胞數(shù)＜5個為陰性，≥5個為陽性。(2)微血管密度 (MVD):在低倍鏡下 (×100)尋找整張切片中富含血管組織的“熱點區(qū)” (hot port)，即棕黃染色密度最高的區(qū)域;在高倍鏡下 (×400)計數(shù)其血管數(shù)目，采用weidner評價標準:以CD34染色為棕黃色的內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞簇記為1條獨立的血管，不以是否形成明顯管腔、腔內(nèi)有無紅細胞存在為判斷標準。每張切片選擇3個高倍視野進行觀察，計算MVD，取平均值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料以 (±s)表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗;計數(shù)資料采用χ2或校正χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 EPO的表達 觀察組EPO主要表達于胞質(zhì)，呈顆粒狀，彌漫性分布 (見圖1A)，陽性表達率為63.8%(37/58);癌旁對照組EPO主要表達于胞質(zhì)，呈顆粒狀 (見圖1B)，陽性表達率為19.0%(11/58);良性病變對照組EPO多呈陰性著色，部分間質(zhì)細胞可見弱著色，陽性表達率為8.9%(4/45)。3組EPO陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2=42.303，P=0.000)，其中觀察組高于癌旁對照組 (χ2=40.121，P=0.000)和良性病變對照組 (χ2=40.343，P=0.000)，而癌旁對照組與良性病變對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2=0.846，P=0.150)。

2.2 EPO陽性表達與患者臨床特征的關(guān)系 不同性別、年齡、pTNM分期、病理類型、分化程度及是否吸煙、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者EPO表達陽性率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，見表1)。

2.3 MVD 3組CD34染色的微血管分布均勻，血管壁完整，形態(tài)較規(guī)整 (見圖2)。觀察組MVD為 (25.72±5.50)，癌旁對照組為 (12.43±3.38)，良性病變對照組為 (10.33±2.88)，3組MVD比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (F=219.14，P=0.000)，其中觀察組高于癌旁對照組 (q=24.30，P＜0.01)和良性病變對照組 (q=26.31，P＜0.01)，而癌旁對照組與良性病變對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (q=3.59，P=0.134)。

2.4 EPO表達與MVD的關(guān)系 觀察組中EPO陽性表達者MVD為 (26.14±5.26)，大于EPO陰性表達者的 (15.97±8.29)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (t=5.34，P=0.001)。

圖1 EPO在非小細胞肺癌組織及癌旁組織的表達 (免疫組織化學(xué)，×100)Figure1 Expression of EPO in NSCLC tissues and adjacent tissues

表1 EPO陽性表達與患者臨床特征的關(guān)系Table1 Relationship of positive expression of EPO and patients'characteristics

圖2 非小細胞肺癌組織及肺良性病變組織中的新生微血管情況(CD34染色，×100)Figure2 Newborn microvascular in NSCLC tissues and benign lesions tissues of lung

3 討論

近年來，隨著相關(guān)領(lǐng)域研究的不斷進展，人們對EPO的認識產(chǎn)生了一次革命性的飛躍。EPO是一種內(nèi)源性促血管生成因子［2－4］，其自分泌/旁分泌通路可以抑制腫瘤細胞和血管內(nèi)皮細胞凋亡，促進腫瘤血管形成及增殖分化，抑制腫瘤細胞凋亡，從而加速腫瘤細胞生長。EPO與腫瘤細胞增殖、抑制凋亡過程及腫瘤細胞對放化療的敏感度有關(guān)，參與了腫瘤的生長、浸潤、轉(zhuǎn)移、耐藥等過程。

本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測EPO在癌組織、癌旁組織及肺良性病變組織中的表達，分析其陽性表達與患者臨床特征間的關(guān)系;采用CD34染色以觀察癌組織、癌旁組織及肺良性病變組織MVD，進而探討EPO表達與MVD間的關(guān)系，以期為NSCLC的臨床診斷和治療提供參考。本研究結(jié)果顯示，觀察組EPO陽性表達率高于癌旁對照組和良性病變對照組，EPO多表達于NSCLC癌細胞胞質(zhì)和 (或)胞膜，以陽性或強陽性表達為主，呈顆粒狀，彌漫性分布。提示EPO可能參與了NSCLC的發(fā)生過程，可將EPO的陽性表達作為NSCLC的輔助性診斷指標。

通過分析EPO陽性表達與患者臨床特征間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，不同性別、年齡、pTNM分期、病理類型、分化程度及是否吸煙、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者EPO表達陽性率均無明顯差異，與Ribatti等［5］報道不一致，分析其原因可能與EPO在不同腫瘤中陽性表達有差異有關(guān)。EPO陽性表達可促進腫瘤新生血管形成，本研究結(jié)果顯示，EPO表達陽性者MVD明顯高于 EPO表達陰性者，與文獻報道一致［6－8］。因此，在NSCLC治療過程中應(yīng)用EPO治療腫瘤相關(guān)的貧血時要考慮患者的獲益及風(fēng)險。

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