子宮內膜癌組織中促凋亡線粒體蛋白BNIP3的表達及意義

牛菲菲，徐 紅，王飛艷

(廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧 530021)

子宮內膜癌是最常見的女性盆腔惡性腫瘤之一，為歐美國家女性生殖系統癌癥發病率首位［1］，嚴重威脅著女性健康。研究子宮內膜癌發生進展的具體機制具有重要的臨床意義。研究發現，在缺氧等條件誘導下，促凋亡線粒體蛋白(BNIP3)可誘導細胞程序性死亡。BNIP3 在肺癌［2］、胃癌［3］、結直腸癌［4］、胰腺癌［5］等多種實體腫瘤中均存在異常表達的現象，但在子宮內膜癌的相關研究甚少。2011年10月～2012年11月，我們通過qRT-PCR和免疫組化方法，觀察子宮內膜癌組織中BNIP3的表達情況，探討其在子宮內膜癌發生發展中的作用及意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2009年1月～2011年9月在廣西醫科大學第一臨床附屬醫院手術切除的子宮內膜癌癌變內膜標本52例作為子宮內膜癌組，均經病理檢查確診為內膜樣腺癌。患者年齡38～75歲、平均54歲。按照 FIGO(2000年修訂版)臨床分期標準，Ⅰ～Ⅱ期31例，Ⅲ～Ⅳ期21例;病理組織分級:高分化(G1)18例，中分化(G2)24例，低分化(G3)10例;有淋巴結轉移14例，無淋巴結轉移38例。收集同期子宮內膜不典型增生的癌前病變內膜組織14例作為不典型增生組，患者年齡38～73歲;選擇因子宮肌瘤等良性病變行子宮切除術的正常子宮內膜組織36例作為對照組，患者年齡38～56歲。各組術中所得標本一分為二，一份立即液氮速凍，置于－80℃冰箱保存備用;另一份用10%甲醛液固定，石蠟包埋，連續切片，片厚約4 μm，用以行免疫組化。各組標本術前均未經放化療及激素治療。

1.2 主要試劑 Trizol試劑盒(Invitrogen公司)，引物由上海生物工程有限公司設計并合成。BNIP3引物:上游 5'-TTCCAGCCTCGGTTTCTATTTA-3'，下游5'-GTTGGTATCTTGTGGTGTCTGC-3'，擴增產物長度137 bp;采用3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)做內參，GAPDH引物:上游5'-GCGCGGCTACAGCTTCA-3'，下游 5'-CTTAATGTCACGCACGATTTCC-3'，擴增產物長度137 bp。BNIP3兔抗人多克隆抗體購自北京中山生物有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 BNIP3 mRNA檢測 采用qRT-PCR法。采用Trizol法提取各組組織中的RNA，進行瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計分析，檢驗RNA的純度及完整度，隨后按照逆轉錄試劑盒的說明書及時將其逆轉錄成cDNA，用以進行實時定量PCR。PCR反應體系為20 μL，包括:SYBR GreenⅠ熒光染料9 μL，上下游引物各0.5 μL，模板 cDNA 1 μL，雙蒸水(ddH2O)9 μL。反應條件為95℃預變性10 min，95℃ 20 s、57℃ 30 s、72℃ 30 s，延伸時檢測熒光信號，共40個循環。反應結束后進行熔解曲線的分析，BNIP3的基因擴增產物可見呈現單一的特異性熔解峰，曲線平穩光滑，波峰的形狀較為銳利，證明產物為特異性擴增。目的基因的擴增情況以傳統的相對定量法(2－ΔΔCt)進行計算分析。

1.3.2 BNIP3蛋白檢測 采用免疫組化SP法。實驗步驟按照試劑盒的說明進行，以自身陽性片作陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。細胞核和(或)細胞質中出現棕黃或棕褐色顆粒，且染色強度明顯高于背景的非特異著色為陽性表達。結果判定采用Formowitz等［6］綜合計分法，每張切片均于高倍鏡(×400)下選擇10個具有代表性的視野，先按陽性細胞百分比打分:0分為陽性細胞百分率≤5%，1分為6%～25%，2分為26%～50%，3分為51%～75%，4分為＞75%;再按染色強度打分:0分為無色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。染色強度評分與陽性細胞百分率評分相加:總和＜2分為陰性，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為陽性(++)，6～7分為強陽性(+++)。(+)、(++)、(+++)均視為陽性。

1.3.3 BNIP3表達水平與臨床病理特征的關系記錄各組患者病理分級、臨床分期、有無淋巴結轉移及肌層浸潤等，比較各指標與BNIP3 mRNA及蛋白表達水平的相關性。

1.3.4 統計學方法 采用SPSS 18.0統計軟件，計量資料用表示，兩樣本均數比較采用t檢驗，多組比較采用方差分析(方差不齊時采用Games-Howell法)，計數資料選用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BNIP3 mRNA表達 子宮內膜癌組、不典型增生組、對照組BNIP3 mRNA的相對表達量分別為1.64 ±0.46、1.99 ±0.59、0.82 ±0.23，不典型增生組高于對照組及子宮內膜癌組，子宮內膜癌組高于對照組(P均 ＜0.05)。

2.2 BNIP3蛋白表達 BNIP3陽性表達主要位于細胞質，部分強染色細胞的細胞核中也可見陽性表達。對照組僅見散在的細胞質陽性表達，且染色較淡;不典型增生組陽性表達以棕黃或棕褐色顆粒為主;子宮內膜癌組雖呈現彌漫性細胞質陽性表達，但以淺黃和棕黃色顆粒為主。不典型增生組BNIP3蛋白陽性率高于子宮內膜癌組及對照組，子宮內膜癌組高于對照組(P均＜0.01)。見表1。

表1 各組BNIP3蛋白表達

2.3 BNIP3 mRNA及蛋白的表達水平與臨床病理特征的關系 BNIP3 mRNA及蛋白在子宮內膜癌的表達水平與病理分級、臨床分期、有無淋巴結轉移及肌層浸潤等均無關(P＞0.05)。見表2。

3 討論

腫瘤的形成往往是因為細胞增殖、分化的機制出現異常，凋亡通路受阻，從而表現為失控性細胞永生化。BNIP3具有調節細胞自主凋亡的能力，在多種實體瘤中均發現存在BNIP3的異常表達，因此BNIP3成為研究腫瘤發生機制的新熱點，但關于其在子宮內膜癌及其癌前病變中的研究卻鮮有報道。

BNIP3/NIP3基因是隸屬于BcL-2家族中的BH3-only亞型，是缺氧誘導因子-1(HIF-1ɑ)的下游靶基因，正常機體內，BNIP3僅疏松地結合于線粒體外膜的胞質側，不能發揮其促凋亡的功能，當體內凋亡信號出現時，BNIP3表達上調，胞質中的BNIP3以同源二聚體的方式與線粒體外膜緊密結合，靠其N端位于胞質側、羧基C末端位于線粒體膜內的途徑誘導線粒體通透性轉運孔開放(MPTP)，線粒體功能受損，導致典型細胞凋亡壞死現象的發生［7］。

表2 BNIP3 mRNA及蛋白表達水平與子宮內膜癌臨床病理特征的關系

研究發現，定位于胞質的BNIP3是正常發揮促凋亡功能的前提和保證［8］。本研究發現，子宮內膜BNIP3的表達主要定位于細胞質，且BNIP3蛋白在子宮內膜癌組(86.5%)、不典型增生組(92.9%)患者中的陽性表達率高于對照組(8.3%)。通過在胰腺癌［5］等腫瘤的研究發現，當陽性表達以胞核為主時，即使存在BNIP3的高表達，也無法發揮其誘導細胞凋亡壞死的能力，甚至會表現為凋亡逃避的反結果。因此，本實驗結果可初步證實上調的BNIP3參與了正常內膜癌變的發生進展過程。

本研究采用熒光定量PCR技術，在轉錄水平檢測了BNIP3的表達情況，結果發現子宮內膜癌組及不典型增生組BNIP3 mRNA的平均表達量均高于對照組，與免疫組化所得出的蛋白水平變化情況相符。Bruick等［9］認為，BNIP3在轉錄水平的上調是其蛋白表達上調的原因之一，因此BNIP3蛋白水平的上調與BNIP3 mRNA的上調相比表現相對滯后。

本研究發現，正常子宮內膜、不典型增生子宮內膜及子宮內膜癌中BNIP3 mRNA及蛋白表達并非呈一種典型的漸進過程，雖然BNIP3在正常內膜明顯低表達，在子宮內膜不典型增生組及子宮內膜癌組高表達，但是BNIP3在不典型增生組的表達卻高于子宮內膜癌組，推測可能為BNIP3表達上調屬于腫瘤發生過程中的極早期事件，即癌前病變過程中該因子的上調現象比較明顯，一旦癌前病變進展為惡性腫瘤，BNIP3的表達將會因為其自身甲基化或抗凋亡因子表達增多等抑制因素的存在，使得原本表達上調的BNIP3無法繼續正常發揮作用，或因被抗凋亡因子大量消耗，呈現出表達相對下調現象。但由于本研究中不典型增生內膜標本例數較少，故BNIP3表達上調在子宮內膜惡變過程中是否屬于早期分子信號，能否作為早期診斷的輔助指標，對于早期診斷子宮內膜癌是否具有重大意義，仍需進一步探究。

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［4］Wang Z，Huang C，Zeng J，et al.Effects of the proapoptotic regulator Bcl-2/adenovirus EIB 19-kDa-interacting protein 3 on the chemosensitivity of human colon cancer cell lines［J］.Oncol Lett，2012，4(6):1195-1202.

［5］Erkan M，Kleeff J，Esposito I，et al.Loss of BNIP3 expression is a late event in pancreatic cancer contributing to chemoresistance and worsened prognosis［J］.Oncogene，2005，24(27):4421-4432.

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［9］Bruick RK.Expression of the gene encoding the proapoptotic Nip3 protein is induced by hypoxia［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97(16):9082-9087.