鐵過載對臍帶血來源的造血干祖細胞及造血支持細胞的作用觀察

肖 霞，趙明峰，盧文藝，柴 笑，穆 娟，鄧 琦，李 青，李玉明

(天津市第一中心醫院，天津 300192)

鐵是人體必需的微量元素，細胞內生理量的鐵在其DNA合成、電子傳遞、氧氣運輸等生物學過程中均發揮了重要的作用。但細胞內鐵過載卻能夠引起組織器官和細胞的損傷。一些血液系統疾病如骨髓異常增生綜合征(MDS)、再生障礙性貧血(AA)、地中海貧血等由于骨髓造血功能異常和紅細胞無效生成需要長期依賴輸血。細胞內過多的鐵通過Haber-Weiss反應催化活性氧物質(ROS)的生成，改變了細胞內的氧化還原狀態。細胞內ROS升高及其所致的抗氧化物質的相應減少，促進脂類、蛋白質和DNA的氧化，進而導致細胞和組織的損傷。而過多的鐵沉積在肝、脾、心臟、胰腺等器官上，也造成了相應器官的衰竭。鐵過載的相關研究顯示，在MDS和地中海貧血患者骨髓細胞中均能發現自由鐵，且祛鐵治療可改善這些患者的癥狀［1］。國外研究證實地中海貧血患者血中ROS水平明顯高于正常人［2］。因此，我們假設鐵過載通過ROS升高影響了骨髓造血功能。2012年3月～2013年3月，我們通過體外培養臍帶血的過程中加入枸櫞酸鐵胺建立體外鐵過載模型，然后檢測其對骨髓造血功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞臍帶血間充質干細胞(UC-MSCs)由中國醫學科學院血液病研究所惠贈，新鮮臍帶血來自本院產科足月健康妊娠產婦分娩后，征得產婦及家屬知情同意后用于科學研究。

1.2 主要試劑 DMEM 低糖培養基、FBS、0.25%胰酶、鼠尾膠原均購自美國Gibco公司，細胞因子IL-3、IL-6、干細胞生長因子(SCF)、FLT-3 配基(FLT-3 ligand，FL)購自美國PeproTech公司，甲基纖維素半固體培養基及H5100培養基購自加拿大Stem cell公司，枸櫞酸鐵銨(FAC)、鈣熒光素乙酰氧基甲酯(calcein-AM)購自美國Sigma公司，ROS檢測試劑盒購自碧云天生物技術公司，AnnexinV-FITC流式細胞術檢測試劑盒購自上海美季公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養

1.3.1.1 臍帶血單個核細胞(UC-MNCs)提取與培養 新鮮臍血標本肝素抗凝后，采用羥乙基淀粉沉淀法聯合Ficoll梯度密度離心法分離UC-MNCs，用完全培養液(含20%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL 鏈霉素和細胞因子 IL-3、IL-6、SCF、FLT-3濃度均為2 μg/L的 RPMI-1640培養液)重懸細胞，以1×106/mL的密度接種于12孔板中。

1.3.1.2 UC-MSCs 培養 用含 15%FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM低糖培養液培養，細胞達到80%～90%融合時，按1∶3進行傳代。取第3代UC-MSCs進行實驗。

1.3.2 實驗分組 分為MNCs-CTL組、MNCs-FAC組、MSCs-CTL組、MSCs-FAC組，每組設3個復孔，實驗重復3次。

1.3.3 鐵過載模型的建立 MNCs-CTL組、MSCs-CTL組細胞常規培養于DMEM培養液中。MNCs-FAC組、MSCs-CTL組向培養液中添加200 μmol/L的FAC，培養24 h后離心換液，于完全培養液中繼續培養。通過測定細胞內不穩定鐵池(LIP)的相對水平判斷鐵過載模型建立是否成功。向MNCs-FAC組和MSCs-FAC組培養液中添加200 μmol/L的FAC培養24 h，細胞內calcein熒光強度分別低于MNCs-CTL組和MSCs-CTL組，說明MNCs-FAC組和MSCs-FAC組細胞內LIP水平相對升高，即細胞外鐵進入細胞內造成細胞鐵過載，成功建立鐵過載模型。

1.3.4 檢測方法 觀察鐵過載的UC-MNCs和UCMSCs細胞內LIP、ROS水平變化;觀察鐵過載對UCMNCs和UC-MSCs細胞的增殖、分化、凋亡的影響。

1.3.4.1 造血細胞集落計數 收集MNCs-CTL組和MNCs-FAC組的UC-MNCs細胞，并計數。在24孔板中進行培養，每孔中甲基纖維素半固體培養基0.5 mL，加入各組 MNCs，1 ×105個。在 37℃ 5%CO2培養箱中培養7～14 d后，在顯微鏡下分別對紅系祖細胞集落形成單位(CFU-E)、粒—單核系祖細胞集落形成單位(CFU-GM)、爆式紅系祖細胞集落形成單位(BFU-E)和混合系祖細胞集落形成單位(CFU-mix)進行計數。

1.3.4.2 各系造血干祖細胞計數 收集 MNCs-CTL組和 MNCs-FAC組的 UC-MNCs 1×106個細胞，用PBS洗滌2次后分別加入10 μL CD33-PE、10 μL GlyA-PE 或 10 μL CD34-PE/CD45-FITC 抗體，陰性對照管加入10 μL PBS，同型對照管加入人鼠抗IgG2-PE 10 μL，室溫避光孵育 15 min，再用 PBS 洗滌2次后重懸細胞，上流式細胞儀檢測。記錄MNCs-CTL組和MNCs-FAC組造血干細胞()、髓系造血細胞()、紅系造血細胞(GlyA+)比例和計數。

1.3.4.3 檢測鐵過載對UC-MSCs增殖功能的影響將MSCs-CTL組和MSCs-FAC組P3代的UCMSCs細胞分別以4×104/孔的密度接種于12孔板上，在37℃的溫箱中培養，當細胞達到融合的時候，用胰酶消化傳代，按以下公式計算UC-MSCs的倍增時間:DT=CT×log2/log(X1/X0)，X0是細胞最初的數量，X1是細胞最終的數量，CT是細胞培養時間。

1.3.4.4 細胞凋亡檢測 將4組的 UC-MNCs和UC-MSCs的細胞調整細胞密度為1×106/mL，按照試劑盒說明進行操作。取100 μL細胞懸液于流式管中，加 5 μL Annexin V-FITC 和 10 μL 碘化丙啶(PI)，以PBS組為陰性對照，混勻后室溫避光孵育15 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.3.4.5 ROS 測定 根據文獻［3］將 MNCs-FAC 組的細胞培養2 d后加入FAC，繼續培養24 h，PBS洗滌細胞2次，調整細胞密度為1×106/mL，加入DCFH-DA，使其終濃度為0.5 μmol/L;將 MSCs-FAC組的細胞以1×105/mL的密度接種于6孔板上，加入FAC，繼續培養24 h，PBS洗滌細胞兩次，加入DCFH-DA，使其終濃度為10 μmol/L;處理細胞15 min后，洗滌細胞3次，每孔加入細胞裂解液700 μL，37℃搖床裂解細胞10 min后將混勻的裂解液加入到96孔板中，在激發波長為488 nm、吸收波長為530 nm下用熒光酶標儀檢測熒光強度。

1.5 統計學方法 使用SPSS17.0統計軟件，采用獨立樣本t檢驗法進行統計學比較，實驗結果以表示，P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 造血細胞集落計數 MNCs-FAC組各集落形成單位數均低于MNCs-CTL組，差異具有統計學意義(P ＜0.05)。見圖1。

圖1 MNCs造血干祖細胞集落形成能力變化

2.2.2 各系造血干祖細胞計數 MNCs-FAC組MNCs細胞數比MNCs-CTL組明顯減少，MNCs-FAC組比例和細胞計數均低于MNCs-CTL 組(P 均 ＜0.05)，見表1。

2.3 鐵過載對UC-MSCs功能的影響 MSCs-FAC組UC-MSCs的群體倍增時間DT為(24.43±2.72)h，MSCs-CTL 組為(16.03 ± 2.31)h，MSCs-FAC 組DT長于MSCs-CTL組(P＜0.05)，細胞增殖能力下降。

表1 不同處理組MNCs 、GlyA+細胞比例和計數的變化(n=3，)

表1 不同處理組MNCs 、GlyA+細胞比例和計數的變化(n=3，)

注:與 MNCs-FAC 組比較，﹡ P ＜0.05

MNCs-CTL 組 10.53 ±1.00 0.61 ±0.06﹡ 0.64 ±0.12﹡ 13.26 ±1.02﹡ 14.04 ±2.32﹡ 24.53 ±1.37﹡ 25.77 ±1.58)﹡MNCs-FAC 組 6.60 ±0.36 0.36 ±0.04 0.24 ±0.03 9.86 ±0.48 6.51 ±0.53 18.25 ±1.21 12.06 ±1.26

2.4 細胞凋亡的變化 UC-MNCs在200 μmol/L的FAC作用24 h后，MNCs-FAC組凋亡率為(20.903.45)%，MNCs-CTL 組為(9.201.29)%，MNCs-FAC組凋亡率高于MNCs-CTL組(P＜0.05)。P3代的UC-MSCs在200 μmol/L的FAC作用24 h后，MSCs-FAC 組的凋亡率為(12.75 ±0.32%)，MSCs-CTL組為(3.63±0.80%)，MSCs-FAC 組的凋亡率高于 MSCs-CTL組(P ＜0.05)。

2.5 鐵過載臍帶血細胞內ROS水平變化 MNCs-FAC組和MSCs-FAC組細胞內ROS水平明顯升高，均高于MNCs-CTL組和MSCs-FAC組(P均＜0.05)。見圖2

3 討論

圖2 鐵過載對臍帶血單個核細胞及間充質干細胞ROS水平的影響

一些血液系統疾病如MDS、AA、地中海貧血等需要長期依賴輸血，導致鐵過載的發生，嚴重影響患者的治療效果和預后。研究發現，體外培養地中海貧血患者骨髓的LIP水平和ROS水平明顯高于正常人，祛鐵處理后，紅系祖細胞的細胞質和線粒體中LIP降低，并且與氧化應激(ROS)的減弱相關［4］。因此，明確鐵過載對造血功能的影響及其機制對臨床改善這些患者的治療和預后有重要意義。相關研究提示鐵過載可造成造血功能的損傷，其機制可能是由于ROS的升高，但是尚缺乏直接的證據證實，如何對造血干祖細胞和造血微環境產生影響也尚不清楚。

臍帶血富含造血干祖細胞及MSC。UC-MSC與骨髓來源的MSC相似，具有向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等分化潛能，它還可通過細胞接觸和分泌細胞因子支持造血。本研究利用體外培養UCMNCs和UC-MSCs的方法檢測鐵過載對造血細胞及造血支持細胞的影響，在200 μmol/L的FAC中，培養UC-MNCs和UC-MSCs，檢測LIP水平增高，提示外源性的鐵可進入細胞誘導細胞鐵過載。本研究發現，通過FAC促使造血干祖細胞鐵過載，MNCs-FAC組的比例和細胞數均明顯減低，各系集落形成單位明顯降低，凋亡比例明顯增加，細胞內ROS水平升高，說明鐵過載引起了造血干祖細胞的損傷，誘導ROS升高，可影響造血干、祖細胞的數量、分化及功能，損傷骨髓造血功能。MSCs是造血微環境的重要組成部分，正常的造血微環境使得造血細胞增殖、分化。本研究發現，鐵過載使MSCs的增殖能力、造血支持能力下降且凋亡率增加。有研究證明，體內聚集大量的ROS可誘導MSCs的DNA損傷，降低DNA的合成及增殖能力，影響其分化能力，甚至可以誘導細胞衰老［5］。鐵過載可造成造血功能的損傷，使造血能力下降，其機制可能是影響了造血干祖細胞的增殖、分化、凋亡以及影響了造血微環境的增殖、凋亡，使其造血支持能力下降。

有文獻報道，細胞內LIP誘導ROS生成。鐵的動態平衡在許多氧化應激涉及的病理過程中起了重要的作用［6］。細胞內適當水平的ROS在調控一些生物學現象中發揮著重要的作用，包括一些信號通路的激活以及這些信號所涉及的基因的表達。然而，各種原因所致的ROS生成增多直接或間接的破壞正常細胞內的氧化和抗氧化系統的平衡，導致細胞的氧化應激反應［7］，從而引起細胞和組織器官的損傷。造血干細胞對非正常的ROS的聚集高度敏感，如果干細胞中ROS長期升高可導致DNA的損傷和老化機制的非正常激活，誘導造血干細胞的老化和凋亡，從而導致造血干細胞再生能力的破壞［8］，進而影響造血干細胞的自我更新和定向分化能力。ROS升高通過多種途徑影響造血干細胞的數量與活性、自我更新能力和細胞周期變化等。參與其中的信號分子主要有 ATM、FoxO、mTOR和AKT等［8］。已有多項研究發現，ROS大量聚集對支持造血的MSCs同樣也具有損傷作用，可影響其增殖、凋亡、分化，近年來，p38MAPK、AKT、p53、ERK等多種信號途徑在ROS介導的MSC衰老、凋亡及增殖分化中的作用有相繼報道［10，11］。

綜上所述，鐵過載是促使ROS升高的原因，且ROS升高影響造血干祖細胞增殖、分化和凋亡，對造血支持細胞尤其是MSCs的增殖及造血支持作用造成損傷，影響了造血功能。因此，我們的研究結果旨在為治療鐵過載患者造血功能低下尋找新的靶點(例如祛鐵治療或抗氧化治療等)提供思路，同時為深入探討ROS對造血機制的影響提供依據。

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